亲环素D的表达增加诱发肝脏脂质沉积的机制研究

摘要

目的:
　　1、明确在高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝中CypD及甘油三酯增加的关系。
　　2、通过运用CypD敲除的小鼠模型和尾静脉注射CypD过表达腺病毒的小鼠模型，证实CypD对肝脏线粒体应激和甘油三酯合成的作用。
　　3、通过体内外实验证实CypD对肝脏SREBP-1c的上调作用。
　　4、体内通过肝脏特异性Ire1α敲除小鼠模型、体外通过小干扰RNA和抑制剂处理，证实CypD通过IRE1α上调肝脏SREBP-1c的表达。
　　5、体内应用CypD抑制剂验证其对肝脏甘油三酯沉积的预防和治疗作用。
　　方法:
　　1、动物模型建立:
　　(1)高脂饮食喂养的小鼠模型
　　8周龄的雄性C57B1/6j小鼠分为两组进行实验，高脂组小鼠进食含60％kca1脂肪的高脂饮食，而对照组进食普通饮食。
　　(2)全身CypD和SREBP-1c基因敲除小鼠
　　在SPF环境饲养并采用杂合子繁殖同窝对照的野生型及敲除小鼠，基因型鉴定后，雄性小鼠约8周龄进行实验。
　　(3)肝脏特异性Ire1α基因敲除小鼠
　　Ire1α-LKO（肝脏特异性Ire1α基因敲除）小鼠是由Ire1flox/flox小鼠和Alb-Cre小鼠交配繁殖得到的。基因型鉴定后，各基因型雄性小鼠约8周龄进行实验。
　　(4)CypD过表达小鼠模型
　　小鼠AdPPIF（CypD过表达）病毒和空载病毒AdEGFP用无菌PBS稀释，以每只C5781/6j小鼠2*108pfu的量进行尾静脉注射，共注射三次，间隔六天。
　　(5)环孢菌素A模型小鼠
　　环孢菌素注射液即医用山地明（简称CsA）用无菌PBS稀释，以每只C57B1/6j小鼠10mg·kg-1·d-1或20mg·kg-1·d-1的量进行腹腔注射;对照组注射相同体积的PBS。连续注射六周。
　　(6)衣霉素模型小鼠
　　先将衣霉素(Tm)用DMSO溶解成母液，浓度为10mg·ml-1，再用无菌PBS稀释母液。Tm组的注射方案是:以每只C57B1/6j小鼠1mg·kg-1·d-1的量进行腹腔注射;对照组注射相同体积的PBS。连续注射两天。
　　2、细胞培养:HepG2细胞根据ATCC细胞培养标准进行培养，小鼠肝原代细胞按照两步胶原酶灌注法进行提取。
　　3、小动物活体成像分析:通过小动物活体成像技术在活体水平观察特定刺激对CypD或SREBP-1c启动子区的调控作用。
　　4、小鼠代谢笼分析:采用小鼠代谢笼分析方法检测特定刺激对小鼠全身水平代谢的影响。
　　5、线粒体肿胀分析:分离肝脏组织线粒体，采用酶标仪检测特定刺激对钙离子触发的线粒体肿胀的影响。
　　6、丙二醛含量分析:采用丙二醛(MDA)检测试剂盒检测特定刺激对肝组织脂质过氧化的影响。
　　7、小鼠血糖、血脂及肝功检测指标:血糖、血脂（甘油三酯、总胆固醇）及ALT、AST，采用Mindrary全自动生化分析仪检测。
　　8、采用试剂盒检测肝脏中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)含量。
　　9、电镜分析:采用透射电镜观察小鼠肝脏线粒体形态及脂质沉积。
　　10、采用H&E和油红O染色检测小鼠肝组织或细胞脂质沉积。
　　结果:
　　1、肝脏脂质沉积继发于亲环素D(CypD)的表达增加
　　用普通饮食或60kcal％的高脂饮食喂养小鼠，在第2、4、8、12周末观察肝脏脂质沉积和线粒体应激关键蛋白CypD的表达。动物活体成像和western blot显示，高脂喂养第4周末，肝脏CypD的荧光素酶活性及蛋白表达升高(p＜0.01)，随喂养周数延长而增加。但直至第8周末，肝脏甘油三酯(TG)含量(p＜0.01)及脂质沉积才有显著增加;提示高脂喂养过程中，肝脏CypD的表达升高早于TG沉积，暗示了CypD与肝脏脂质沉积的潜在相关性，为CypD在脂肪肝发病中的作用研究提供实验依据。
　　2、CypD与肝脏线粒体应激和脂质沉积呈正相关
　　为研究CypD与肝脏TG沉积的关系，我们引入全身CypD基因敲除小鼠模型和肝脏CypD过表达模型，在基因敲除模型中采用普通饮食和高脂饮食喂养。
　　(1)全身代谢的分析
　　代谢笼数据显示:普通饮食喂养下，CypD敲除鼠与野生型相比，氧耗和能量消耗无明显变化;而高脂喂养时，CypD敲除提高了小鼠的氧耗和能量消耗。另一方面，肝脏CypD过表达对小鼠氧耗和能量消耗的影响不大，提示CypD并不直接影响全身代谢水平。
　　(2)血清学指标分析
　　已有研究证实CypD敲除可缓解高脂诱导的胰岛素抵抗，我们的血清学结果显示，CypD敲除可降低高脂饮食下小鼠血清葡萄糖水平，而且血清TG水平也明显降低(p＜0.05);普通饮食情况下，CypD敲除对小鼠血脂的影响不大。
　　(3)肝脏线粒体应激和脂质沉积分析
　　普通饮食喂养下，CypD敲除鼠与野生型相比，肝脏TG水平略有下降，而CypD敲除可明显减轻高脂诱导的肝脏TG沉积(p＜0.01);CypD敲除对肝脏胆固醇水平无明显影响。同时我们观察CypD敲除对肝脏线粒体应激的影响:高脂喂养的野生型小鼠与普通饮食组相比，线粒体肿胀明显增强(p＜0.05)，CypD敲除消除了这种差异;CypD敲除也减少了线粒体活性氧的产生(p＜0.01)。另一方面，尾静脉注射CypD过表达组与空载病毒组相比，肝脏TG含量(p＜0.05)增加、肝脏线粒体肿胀(p＜0.05)和活性氧积聚加重。说明CypD敲除减轻了高脂诱导的肝脏线粒体应激和TG沉积，而肝脏CypD过表达可加重肝脏线粒体应激和TG沉积;提示肝脏TG沉积依赖于线粒体CypD的表达。
　　3、CypD通过TG合成的关键酶SREBP-1c调控肝脏TG沉积
　　通过PCR array筛选及qPCR验证，CypD敲除明显抑制了高脂诱导的肝脏SREBP-1c的mRNA表达(p＜0.05)。高脂喂养可以明显增加SREBP-1c前体（p-SREBP-1c）和成熟体（n-SREBP-1c）的蛋白表达;而CypD敲除消除了高脂对SREBP-1c的作用，提示CypD可能调控SREBP-1c。肝脏CypD过表达小鼠模型中，肝脏SREBP-1c的荧光素酶活性和蛋白表达就空载病毒组明显升高;而SREBP-1c敲除也消除了CypD过表达对TG的增加作用(p＜0.01)，说明CypD通过SREBP-1c调控肝脏TG沉积。
　　4、CypD通过内质网应激关键分子IRE1α调控肝脏SREBP-1c表达
　　研究显示CypD引起的活性氧积聚可激活p38MAPK，而p38MAPK又是联系线粒体应激和内质网应激的桥梁。我们的研究显示，CypD敲除可减少高脂诱导的肝脏p38MAPK、磷酸化IRE1α蛋白表达，并缓解内质网肿胀。在肝脏特异性Ire1α基因敲除小鼠模型中，CypD无法上调肝脏SREBP-1c的荧光素酶活性、蛋白表达及脂质沉积。说明在CypD诱导SREBP-1c表达的过程中IRE1α发挥不可或缺的作用，在体内实验层面初步探讨CypD的作用机制。
　　5、CypD通过Ca2+/p38MAPK/IRE1α通路调控SREBP-1c
　　我们分别在小鼠肝原代和人HepG2细胞上发现，CypD依次通过调控细胞内Ca2+含量、活性氧积聚，激活p38MAPK/IRE1α通路，增加肝脏SREBP-1c的mRNA(p＜0.01)、蛋白表达及TG沉积(p＜0.01)。分别应用p38MAPK和IRE1α的抑制剂，以及肝脏特异性Ire1α基因敲除小鼠的原代细胞，在体外实验层面证实CypD通过Ca2+/p38MAPK/IRE1α增加SREBP-1c的表达，揭示了CypD发挥作用的分子通路。
　　6、CypD抑制剂对非酒精性脂肪肝的预防和治疗作用
　　我们在体内应用CypD抑制剂---环孢菌素A(CsA)，寻求脂肪肝的预防和治疗途径。运用高脂喂养的小鼠模型，分别在第4周和第30周末腹腔注射CsA，模拟肝脏脂质沉积发生之前和严重脂质沉积两个阶段。CsA减轻了两个阶段中高脂诱导的肝脏活性氧沉积，证明其发挥了抑制线粒体应激的作用;同时检测到CsA减少了肝脏SREBP-1c的荧光素酶活性、蛋白表达以及TG含量(p＜0.01)。为了消除CsA的继发作用，我们在体外应用CypD的小干扰RNA，同样证实CypD抑制剂可减少肝脏SREBP-1c表达，为脂肪肝的防治提供了新的依据。
　　结论:
　　1、在高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝中，CypD的表达增加早于甘油三酯的沉积。
　　2、CypD的表达增加可引发肝脏线粒体应激和甘油三酯沉积。
　　3、CypD上调肝脏甘油三酯沉积的机制是通过Ca2+/p38MAPK/IRE1α/SREBP-1c通路实现的。
　　4、CypD抑制剂CsA可预防和治疗肝脏甘油三酯沉积，为NAFLD的防治提供新靶点。

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