慢性酒精性脂肪肝发病中肝细胞MAPK活性的变化及其作用

摘要

研究目的:
　　酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是过量摄入酒精导致的一系列肝脏进展性疾病，包括酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver，AFL）、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化、肝硬化，甚至是肝癌。AFL是酒精导致肝脏病变的第一个阶段，因其具有可逆性而成为了防治ALD的研究重点。AFL的发病机制复杂，涉及体内多种代谢活动及信号通路，大量研究表明氧化应激在AFL的形成中发挥了重要的作用。细胞色素P4502E1(cytochrome P4502E1，CYP2E1)是微粒体乙醇氧化系统(microsomal ethanol oxidation system，MEOS)的重要组成部分，也是酒精暴露后肝脏内活性氧(reactive oxygen species，ROS)的主要来源。研究表明CYP2E1的活化是AFL发病的重要原因。
　　丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是真核细胞内广泛存在的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能够被包括ROS在内的多种因素激活，参与细胞增殖、凋亡、炎症反应等多种生理、病理活动。研究证实，MAPK信号通路对细胞内的脂肪代谢活动具有调控作用。那么，MAPK的磷酸化水平在慢性乙醇暴露下发生了怎样的变化？这种变化与CYP2E1是否有关？MAPK磷酸化水平改变后，又是通过什么机制介导AFL形成？这些都是亟待解决的研究问题。
　　本课题拟通过液体饲料诱导的慢性AFL小鼠模型，动态检测小鼠肝脏内MAPK、CYP2E1及调控肝脏脂肪代谢的甾醇调节元件结合蛋白-1c(sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c)、过氧化物酶体增殖物活化受体-α（peroxisomal proliferator activator receptorα，PPAR-α）的蛋白表达水平，并进一步检测MAPK激动剂对AFL的拮抗作用。体外实验采用HepG2细胞为研究对象，测定不同时间、剂量乙醇暴露对细胞内MAPK磷酸化水平的影响;并进一步测定暴露于同等乙醇剂量下，转染CYP2E1的CYP2E1-HepG2细胞和阴性对照NC-HepG2细胞的MAPK磷酸化水平;最后通过MKP-1siRNA干扰HepG2细胞激活MAPK，测定细胞内PPAR-α及SREBP-1c的蛋白水平。通过上述研究，以期揭示MAPK的活性在慢性AFL发病中的变化及其作用。
　　研究方法:
　　1.动物实验
　　1.1 MAPK信号通路活性在慢性AFL发病中的动态变化:SPF级雄性ICR小鼠(18-22g)适应性喂养3d后，随机分为对照组和AFL模型组(n=40)。AFL模型组小鼠喂饲含有5％乙醇(m/v)的液体饲料诱导AFL，对照组小鼠给予等热量不含乙醇的液体饲料。在1W、2W、3W、4W四个时间点，分别从两组小鼠中随机选取10只处死，取肝脏及附睾脂肪称重，测定肝组织内甘油三酯(triglycerides，TG)的含量、肝组织内MAPK及脂肪代谢关键分子PPAR-α、SREBP-1c等的蛋白水平动态变化。
　　1.2 表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)对AFL的干预作用:SPF级雄性ICR小鼠随机分为对照组、AFL模型组及干预组(n=10)。AFL模型组和EGF干预组小鼠喂饲含有5％乙醇(m/v)的液体饲料，对照组小鼠喂饲等热量的液体饲料，连续四周。从第二周开始，EGF干预组小鼠腹腔注射给予250μg/kg·bw EGF，其余两组小鼠给予等体积生理盐水。4周末处死小鼠，通过病理检查及肝组织TG的测定评价EGF的干预效果。
　　2.细胞实验
　　2.1 不同时间、不同剂量乙醇暴露下HepG2细胞内MAPK磷酸化水平的变化:分别以0mM、100mM和200mM三个剂量的乙醇处理HepG2细胞1h、1d和5d，western blotting测定细胞内MAPK的磷酸化水平。
　　2.2 CYP2E1对HepG2细胞MAPK磷酸化水平的影响:CYP2E1-HepG2细胞、NC-HepG2细胞暴露于200mM乙醇1d或5d，同时设置相应的0mM对照组，实验结束后收集细胞，测定细胞内TG含量及MAPK的磷酸化水平。
　　2.3 MKP-1siRNA干预对HepG2细胞内脂肪代谢调控蛋白的影响:采用MKP-1siRNA转染HepG2细胞，敲低其MKP-1的mRNA表达，western blotting测定HepG2细胞内PPAR-α和SREBP-1c的蛋白水平变化，探讨MAPK对肝细胞内脂肪分解和合成代谢的影响。
　　研究结果:
　　1.慢性AFL小鼠肝脏脂肪蓄积情况:与对照组小鼠相比，模型组小鼠肝重及肝脏系数增加，各时间点下模型组小鼠肝组织TG水平均显著升高（P＜0.05）。病理结果显示，模型组小鼠肝脏内有大量脂肪滴堆积。
　　2.慢性AFL小鼠肝组织MAPK磷酸化水平的改变:与对照组小鼠相比，模型组小鼠肝组织内p-ERK的蛋白水平在1W、2W、4W时间点分别降低了22.31％、48.45％和21.81％（P＜0.05），p-p38的蛋白水平在2W和4W时间点分别降低了28.19％、42.00％(P＜0.05)，p-JNK的蛋白水平在1W和2W时间点分别降低了42.60％、59.74％(P＜0.05)。ERK、p38和JNK的总蛋白水平在两组间无显著差异。
　　3.慢性AFL小鼠肝组织CYP2E1表达水平的变化:与对照组小鼠相比，各时间点下模型组小鼠肝组织CYP2E1的蛋白水平显著升高，4个周分别升高了110.22％、62.27％、100.85％和64.93％(P＜0.05)。
　　4.慢性AFL小鼠肝组织PPAR-α及SREBP-1c的蛋白水平变化:与对照组小鼠相比，模型组小鼠肝组织PPAR-α的蛋白水平显著降低，在3W时间点降低了64.36％(P＜0.05)。SREBP-1c的蛋白水平在两组间则无显著差异。
　　5.MAPK活化对慢性AFL小鼠肝脏脂肪病变的影响:慢性AFL小鼠腹腔注射EGF后，小鼠肝脂肪病变得到了缓解，肝组织内脂肪滴明显减少，TG含量显著降低（P＜0.05）。
　　6.乙醇暴露对HepG2细胞MAPK磷酸化水平的影响:与对照组细胞相比，乙醇暴露组HepG2细胞中p-ERK的蛋白水平在1h时间点显著增高、5d时间点显著降低(P＜0.05)，p-p38的蛋白水平在1d时间点显著降低、5d时间点显著增高(P＜0.05)，p-JNK的蛋白水平在各时间点下均显著增高（P＜0.05）。
　　7.CYP2E1活化后HepG2细胞内MAPK磷酸化水平的改变:乙醇暴露1d，与各自的对照组细胞相比，NC-HepG2和CYP2E1-HepG2细胞内p-ERK、p-p38的蛋白水平均显著增加(P＜0.05)，CYP2E1-HepG2细胞内p-JNK的蛋白水平显著增加（P＜0.05）。乙醇暴露5d，两种细胞p-ERK的蛋白含量呈降低趋势（P＜0.05），p-p38的蛋白水平显著增加（P＜0.05），NC-HepG2细胞中的p-JNK显著增加(P＜0.05)，而CYP2E1-HepG2细胞中p-JNK呈降低趋势（P＜0.05）。同等剂量乙醇暴露下，与NC-HepG2细胞相比，CYP2E1-HepG2细胞内p-ERK和p-p38的蛋白水平显著降低(P＜0.05)，p-JNK的蛋白水平也呈降低趋势（P＞0.05）。
　　8.MAPK磷酸化水平改变对HepG2细胞TG水平的影响:乙醇暴露后两种细胞的TG水平均显著增高（P＜0.05），同等剂量乙醇暴露下CYP2E1-HepG2细胞TG水平显著高于NC-HepG2细胞（P＜0.05）。
　　9.MKP-1siRNA干扰HepG2细胞后脂肪调控蛋白水平的改变:MKP-1siRNA干扰细胞后，HepG2细胞内PPAR-α的蛋白水平显著高于阴性对照组，其中两条siRNA干预后，细胞内PPAR-α的蛋白水平分别提高了67.94％、82.92％(P＜0.05)。细胞内SREBP-1c的蛋白水平在MAPK激活后则无明显变化。
　　研究结论:
　　1.慢性乙醇暴露抑制了肝组织内MAPK的磷酸化，其作用可能与CYP2E1的活化有关。
　　2.MAPK磷酸化水平的降低可能通过干扰PPAR-α的活性介导酒精性脂肪肝的发生。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

酒精性肝病的流行病学及研究意义

酒精性脂肪肝的发病机制研究进展

MAPK与脂肪代谢

本课题的研究思路

实验材料

1．主要试剂

2．主要仪器

研究方法

1．慢性AFL模型的建立及EGF干预

2．小鼠体重、肝重、脂肪重、肝脏系数及脂肪系数

3．肝脏病理学检查

4．肝脏TG含量的测定

5．HepG2细胞的乙醇暴嚣

6．MKP-1 siRNA转染HepG2细胞

7．western Blotting测定蛋白含量

8．实时定量PCR(quantitative real time，qImPcR)检测mRNA的表达

9．数据分析

研究结果

1．小鼠的一般状况

2．AFL模型小鼠肝脏脂肪蓄积情况

3．慢性AFL模型小鼠肝组织MAPK蛋白水平的变化情况

4．慢性AFL模型小鼠肝组织中脂肪代谢调控蛋白水平的变化

5．慢性AFL模型小鼠肝组织内CYP2E1蛋白水平的变化

6．MAPK活化对慢性AFL的拮抗作用

7．乙醇暴露对HepG2细胞MAPK磷酸化水平的影响

8．乙醇暴露下CYP2E1-HepG2细胞MAPK磷酸化水平的变化

9．MKP-1 siRNA干预对HepG2细胞脂肪调控蛋白的影响

讨论

慢性AFL模型下MAPK磷酸化水平的变化

CYP2E1活化对MAPK磷酸化水平的影响

MAPK对肝脏内脂肪代谢蛋白的调控作用

结论

参考文献

致谢

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