硫化氢通路在蛋白酶激活受体4相关膀胱疼痛中的作用及机制研究

摘要

前言：
　　膀胱疼痛是泌尿外科最常见的内脏性疼痛，是间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征(IC/BPS)的典型表现。间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征是一种慢性非细菌性膀胱炎性难治性疾病，伴有下尿路症状（尿频或尿急），但不伴有明显的膀胱病理性改变。其严重影响患者的生活质量，尤见于女性，并且随着年龄增加，IC/BPS发病率也跟着增加。
　　目前有多种小鼠模型模拟IC/BPS的一种或多种症状，我们采用膀胱灌注蛋白酶激活受体4激活肽（PAR4-AP）构建小鼠疼痛模型，因为蛋白酶激活受体4有明显的诱发疼痛效应，而且IC/BPS患者尿液中蛋白酶水平明显增高。本课题欲通过以下两部分内容探讨硫化氢通路在蛋白酶激活受体4相关膀胱疼痛中的作用及可能机制:(1)探究硫化氢信号通路通过巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)介导蛋白酶激活受体4(PAR4)诱发的小鼠膀胱疼痛模型;(2)探究H2S信号通路对蛋白激活受体4诱导的膀胱疼痛模型膀胱炎症以及排尿行为的影响。
　　第一部分 硫化氢信号通路介导蛋白酶激活受体4(PAR4)诱导的膀胱痛阈改变
　　目的：
　　膀胱灌注PAR4-AP诱导膀胱疼痛模型，给予H2S相关药物进行处理，检测小鼠膀胱疼痛行为的改变，以及小鼠膀胱中H2S及相关酶的改变，从而探究硫化氢信号通路在蛋白酶激活受体4(PAR4)中诱导膀胱痛阈改变的作用。
　　方法：
　　1.实验分组
　　10-13周龄健康雌性C57BL/6J小鼠分为12组，前10组每组随机分配24只小鼠，最后2组每组随机分配6只小鼠，小鼠用戊巴比妥钠麻醉，插入尿管（PE10，长11mm），按压腹部排出尿液。其中，前10组小鼠每组18只小鼠处理之前手术切除双侧输尿管，以防止肾脏来源的尿液影响实验结果，膀胱灌注1小时后收集尿液并处死，尿液至于-80℃冰箱储存;前10组其余6只小鼠以及后2组小鼠不施行手术，仅给予膀胱灌注，24小时后检测小鼠疼痛行为以及排尿行为。
　　SV-HUC-1细胞置于24孔板、在含有10％胎牛血清的F12K培养基中孵育，实验前1小时，用新鲜的培养基替换原培养基，分为16组，每组重复3次。
　　2.实验过程
　　由弱到强使用四种不同力度的Von Frey纤维丝0.008g、0.020g、0.040g、0.070g分别刺激小鼠下腹部，记录给予小鼠药物24小时前后不同力度下的膀胱疼痛反应;利用蛋白质印迹(Western blot)检测膀胱组织中H2S生成酶CBS和CSE的表达情况;利用免疫组织化学染色(IHC)检测膀胱组织中CBS和CSE表达的部位;利用实时荧光定量PCR（real-time qPCR）检测cbs和cse的表达情况;利用H2S释放实验检测人、小鼠模型、细胞模型中H2S生成酶活性;利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测不同处理组细胞及膀胱组织、膀胱灌注液中MIF表达情况。
　　3.数据处理
　　所有的数据利用SPSS进行分析，数据采用平均数±标准误表示，用t检验或者one-way ANOVA，每组至少六只小鼠，细胞实验重复三次，以P＜0.05为有显著统计学差异。
　　结果：
　　1.硫化氢信号系统存在于小鼠膀胱粘膜和人膀胱SV-HUC-1细胞
　　荧光实时定量PCR和蛋白质印迹法检测结果显示小鼠膀胱和人膀胱SV-HUC-1细胞中有CBS和CSE表达;免疫组织化学染色检测证明CBS和CSE广泛表达于小鼠膀胱粘膜层细胞的细胞膜和细胞核中。为了检测小鼠膀胱组织和人膀胱SV-HUC-1细胞中是否能够产生H2S，我们留取模型小鼠膀胱灌注1小时后的膀胱灌注液以及人膀胱SV-HUC-1细胞匀浆物行硫化氢释放实验，结果显示小鼠膀胱灌注液可检测到H2S，并且CBS抑制剂AOAA和CSE抑制剂PAG处理组小鼠膀胱灌注液H2S水平减少，NaHS处理组小鼠膀胱灌注液H2S水平增高;细胞实验与之相对应。
　　2.蛋白酶激活受体4(PAR4)激活后硫化氢信号系统上调
　　荧光实时定量PCR和蛋白质印迹法检测PAR4-AP或者对照肽处理后人膀胱SV-HUC-1细胞和模型小鼠膀胱CBS和CSE的表达量，然而，CBS和CSE蛋白表达量并没有明显差异;H2S释放实验检测显示PAR4-AP处理后的人膀胱SV-HUC-1细胞、模型小鼠膀胱以及人正常膀胱组织H2S生成量均明显增加。
　　结论：
　　1.CBS和CSE在SV-HUC-1细胞以及小鼠膀胱组织中表达并能发挥作用，内源性产生H2S;我们首次证明CBS存在于小鼠膀胱。
　　2.蛋白酶激活受体4激活后能够增强SV-HUC-1细胞以及小鼠膀胱组织中硫化氢合成酶活性，从而促进SV-HUC-1细胞以及小鼠膀胱组织中H2S生成，系我们首次发现。
　　3.膀胱内灌注PAR4-AP能够引起膀胱痛觉超敏感，而且这种疼痛能够被H2S增强。
　　4.H2S可能通过MIF介导PAR4小鼠膀胱疼痛模型。
　　第二部分 硫化氢信号通路对蛋白酶激活受体4(PAR4)诱导的膀胱疼痛模型炎症以及排尿功能的影响
　　目的：
　　构建PAR4-AP诱导膀胱疼痛模型，给予H2S相关药物进行处理，检测小鼠膀胱炎症指标改变情况，以及小鼠排尿行为，从而探讨硫化氢信号通路对蛋白酶激活受体4(PAR4)诱导的膀胱疼痛模型炎症以及排尿功能的影响。
　　方法：
　　1.实验分组
　　构建蛋白酶激活受体4诱导的小鼠间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征模型同第一部分
　　构建环磷酰胺诱导的小鼠间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征模型，10-13周龄健康雌性C57BL/6J小鼠分为4组，每组随机分配4只小鼠。(1)环磷酰胺(i.p.200mg/kg)4小时后处死;(2)生理盐水(i.p.)4小时后处死;(3)环磷酰胺(i.p.75mg/kg)分别于第1天、第4天、第7天注射，第8天处死;(4)生理盐水(i.p.)分别于第1天、第4天、第7天注射，第8天处死。
　　2.实验过程
　　称重小鼠膀胱以及小鼠体重，根据比值判断膀胱水肿程度;利用H&E染色方法从组织学角度检测小鼠膀胱水肿、中性粒细胞浸润等炎症程度;利用无创小鼠排尿行为检测尿斑实验法(VSA)检测小鼠排尿量及排尿频率的情况;利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TNFα、IL4表达量改变。
　　3.数据处理
　　所有的数据利用SPSS进行分析，数据采用平均数±标准误表示，用t检验或者one-way ANOVA，每组至少六只小鼠，以P＜0.05为有显著统计学差异。
　　结果：
　　1.硫化氢介导蛋白酶激活受体4膀胱疼痛模型不引起膀胱水肿
　　我们称重小鼠膀胱以及小鼠体重，取其比值进行统计，发现实验组和对照组相比，比值没有显著统计学差异;而环磷酰胺诱导的小鼠间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征模型能引起明显的膀胱水肿，小鼠膀胱与体重比值，实验组和对照组相比有明显统计学差异;H2S本身不会引起膀胱水肿，并且也不会引起PAR4诱导的膀胱疼痛模型膀胱水肿。
　　2.硫化氢介导蛋白酶激活受体4膀胱疼痛模型不引起膀胱组织学炎性改变
　　PAR4诱导的膀胱疼痛模型不引起明显的膀胱炎性改变，而环磷酰胺诱导的小鼠间质性膀胱炎模型能引起明显的膀胱炎症，表现为中性粒细胞浸润，粘膜水肿;H2S本身不会引起膀胱水肿，并且也不会引起PAR4诱导的膀胱疼痛模型膀胱炎症。
　　3.硫化氢介导蛋白酶激活受体4膀胱疼痛模型不引起排尿行为学改变
　　PAR4激活，经过H2S相关药物的处理，小鼠尿斑数目、尿斑总面积、主尿斑数目、主尿斑总面积以及主尿斑总面积/尿斑总面积均没有统计学差异。
　　4.硫化氢在蛋白酶激活受体4相关炎性因子中的作用
　　荧光实时定量检测蛋白酶激活受体4激活后Th1型转录因子T-bet没有变化，但是Th2型转录因子GATA-3明显增高;ELISA检测试剂盒检测TNFα没有明显改变，而IL4表达明显增加;但是H2S处理之后IL4表达均降低。
　　结论：
　　1.蛋白酶激活受体4引起的膀胱疼痛不伴有明显膀胱炎性改变，H2S在其中亦不发挥抗炎或者促炎效应。
　　2.蛋白酶激活受体4引起的膀胱疼痛不伴有排尿行为改变，H2S在其中亦不影响排尿行为。
　　3.蛋白酶激活受体4引起的膀胱疼痛影响Th2型细胞以及IL4的表达。
　　4.纵观全局，蛋白酶激活受体4诱导的膀胱疼痛模型是一种新型的间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征小鼠模型，能够引起膀胱痛觉超敏感，但是不伴有明显的膀胱炎性改变以及排尿行为变化。H2S合成酶活性异常以及H2S含量的异常可能与蛋白酶激活受体4激活后膀胱疼痛行为改变密切相关。H2S/CBS/CSE信号通路在间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征中可能发挥重要作用，我们的研究为诊断和治疗间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征提供了新的思路。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 硫化氢信号通路介导蛋白酶激活受体4(PAR4)诱导的膀胱痛阈改变

前言

研究目的

材料与方法

结果

讨论

结论

附录图表

参考文献

第二部分 硫化氢信号通路对蛋白酶激活受体4(PAR4)诱导的膀胱疼痛模型炎症以及排尿功能的影响

前言

研究目的

材料与方法

结果

讨论

结论

附录图表

参考文献

致谢

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