靶向流感神经氨酸酶430-腔的奥司他韦衍生物的设计、合成与活性评价

摘要

流行性感冒是由流感病毒引起的一种急性上呼吸道传染病，具有高致病率和高致死率的特点，严重威胁人类的健康和生命。全球每年因季节性流感造成的严重病例高达300-500万，死亡人数达25-50万人。因此，对流感的预防与治疗已成为世界公共卫生领域非常紧迫的任务。
　　鉴于神经氨酸酶(NA)在流感病毒生命周期中的关键作用，已成为目前抗流感病毒药物设计的重要靶点。迄今为止，已经有四种神经氨酸酶抑制剂(NAI)上市，分别是扎那米韦、奥司他韦、帕拉米韦和拉尼娜米韦。但是耐药性毒株的广泛出现和给药不便等问题使目前的抗流感形势依旧严峻，因此开发新型、高效、抗耐药的NA抑制剂仍具有重要意义。
　　最新研究发现:邻近NA活性口袋的Arg430-Thr439等氨基酸形成的430-环具有较高的柔韧性，以致于形成了一个体积很大的空腔，被命名为430-腔，它直接与活性中心相连，可以作为附加的NAI的结合区域。同时，通过对NAI/NA的三维晶体复合物的分析，我们还发现奥司他韦的C-1位羧基正朝向NA的430-腔，可作为靶向于430-腔的修饰位点。本论文基于以上发现，运用基于靶标结构的“多位点结合”的药物设计策略，以奥司他韦为先导化合物，在其C-1位羧基上进行修饰，使其侧链伸入430-腔，通过最大程度的占据该受体口袋，以有效提高配体与靶点的结合力，提高化合物的抗病毒活性;同时使侧链与430-腔内关键（保守）氨基酸形成“附加”作用力，以弥补其它位点氨基酸突变造成的结合力缺失，从而提高化合物的抗耐药性。
　　本论文设计合成了三系列共38个靶向于430-腔的奥司他韦衍生物，并通过生物活性测定，评价了它们的抗流感活性。本论文具体包括以下三部分内容:
　　第一部分:通过文献调研我们发现430-腔中含有较多疏水性氨基酸残基，于是我们将脂肪胺和芳香胺等多种含有疏水性基团的取代胺基通过酰化反应引入奥司他韦的C-1位侧链，使侧链伸入430-腔，与其中的疏水性氨基酸形成输水性作用，进而增强两者的结合能力。最终设计合成了21个目标化合物。体外抑酶活性实验显示，该系列衍生物大部分对H5N1和H5N6亚型具有的抑酶活性，其中活性最好的是C-1位侧链上含有联苯基团的化合物A-17(H5N1:IC50=0.96μM;H5N6:IC50=0.99μM)。通过分子对接研究发现，正是因为联苯基团增加了侧链的长度，使侧链末端的苯环可以深入430-腔内部，在更大程度上占据了430-腔，从而展现出优于该系列其它化合物的NA抑制活性。
　　第二部分:在第一部分工作的基础上，我们以增加侧链长度和增强连接片段与430-腔的相互作用为出发点，通过Clcik反应将药物化学领域的明星片段1，2，3-三氮唑基团引入奥司他韦C-1位侧链。以该基团作为连接片段，可以使侧链增加5(A)的长度，使侧链触及430-腔深处，占据空腔内更大的空间，此外1，2，3-三氮唑基团自身既是氢键供体又是氢键受体可以与430-腔开口处的精氨酸形成A系列中苯环无法形成的氢键作用，进一步增加化合物与活性中心的结合作用。基于此我们设计合成了11个目标化合物。体外抑酶活性实验显示，本系列奥司他韦衍生物大音部分对H5N1和H5N6都具有较好的抑酶活性，特别是目标化合物B-5的活性(H5N1:IC50=0.24μM;H5N6:IC50=0.18μM)明显优于第一系列化合物，这一发现印证了将三氮唑基团引入神经氨酸酶抑制剂的修饰是一种极具前景的策略，但是该系列化合物的活性依旧不如先导化合物OSC(Oseltamivir carboxylate)，且对耐药株H5N1-H274Y的NA抑制活性也远低于OSC。
　　第三部分:本论文中前两部分设计合成的化合物失去了与活性中心正电性区域三个精氨酸的氢键作用，这是化合物活性降低的关键原因。为克服此问题，该部分研究选择在C-1位侧链上引入不同的氨基酸，通过氨基酸上的羧基保持与原位点的氢键作用，同时氨基酸分子的其他部位则可以探入430-腔中与其内部氨基酸形成额外作用。根据该思路我们设计合成了6个目标化合物，体外抑酶活性实验显示，本系列衍生物对H5N1和H5N6都具有较好的抑酶活性，其中活性最高的化合物C-2的抑酶活性(H5N1:IC50=0.088μM;H5N6:IC50=0.096μM)和细胞活性(H5N1:EC50=4.26μM;H5N6:EC50=1.31μM)与OSC相当，对耐药株H5N1-H274Y的抑酶活性也与OSC接近。在鸡胚抗流感病毒模型中，化合物C-2在10mml/L的浓度下对H5N6毒株展现了比OSC更强的抗流感病毒活性。
　　总结:本论文根据NA/NAI的三维晶体复合物的分析，以最新发现的与NA活性中心直接相连的430-腔为辅助结合位点，按照基于靶标结构的“多位点结合”药物设计策略，设计合成了三个系列38个化合物，这些化合物分层次地对430-腔的适配性进行了探索，并在之前工作的基础上不断进行优化，最终得到了和先导化合物活性相当的化合物C-2，该化合物在鸡胚模型中对H5N6毒株展现了优于先导化合物OSC的抗流感病毒活性。同时，本论文对430-腔化学空间的探索为新一代NAI的研发提供了重要信息。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

一、流感病毒的结构

二、流感病毒的分类

三、流感病毒的生命周期

第二节 流感的预防和治疗

二、小分子抗流感病毒药物

第三节 神经氨酸酶及神经氨酸酶抑制剂

一、神经氨酸酶的结构

二、NA的催化机理和生物学功能

三、流感病毒NA抑制剂的设计

四、流感病毒NA抑制剂的研究进展

第四节 NA抑制剂的耐药问题

第五节 本章小结

第二章 靶向于NA 430-腔的“多位点结合”奥司他韦衍生物的设计、合成与生物活性评价

第一节 靶向于430-腔的“多位点结合”奥司他韦衍生物的设计

一、仪器与试剂

二、A系列化合物的合成

三、A系列的合成步骤

四、实验合成讨论与光谱学特征

第三节 目标化合物的生物活性评价

一、NA抑制活性测定方法

二、A系列化合物的酶抑制活性结果与讨论

第四节 分子对接研究

第五节 本章小结

第三章 三氮唑类奥司他韦衍生物的设计、合成与生物活性评价

第一节 三氮唑类C-1位修饰奥司他韦衍生物的设计

一、仪器与试剂

二、B系列化合物的合成

三、B系列的合成步骤

四、实验合成讨论与光谱学特征

第三节 目标化合物的生物活性评价

一、NA抑制活性测定方法

二、B系列化合物的酶抑制活性结果与讨论

第四节 分子对接研究

第五节 本章小结

第四章 奥司他韦-氨基酸类衍生物的设计、合成与生物活性评价

第一节 奥司他韦-氨基酸类衍生物的设计

一、仪器与试剂

二、C系列化合物的合成

三、C系列的合成步骤

四、实验合成讨论与光谱学特征

第三节 目标化合物的抑酶活性评价

二、酶抑制活性结果与讨论

第四节 分子对接研究

第五节 细胞水平抗流感病毒活性评价

一、细胞水平抗流感病毒测试原理

二、实验材料

三、细胞水平抗流感病毒活性测试方法

四、细胞水平抗流感病毒活性和细胞毒性测试结果与讨论

第六节 鸡胚模型中抗流感病毒活性评价

一、鸡胚中抗流感病毒活性测定方法

二、鸡胚模型中抗流感病毒活性结果与讨论

第七节 本章小结

第五章 总结与展望

第一节 总结

第二节 展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

附录