牛流行热病毒感染宿主细胞差异表达miRNA的筛选及其鉴定

摘要

牛流行热(Bovine Ephemeral Fever，BEF)是由牛流行热病毒(Bovine Ephemeral Fever Virus，BEFV)引起的一种牛的急性热性传染病，能迅速地发生和传播。该病发病率高、死亡率低，可导致奶牛减产、牛乳品质下降、公牛繁殖能力降低及役用牛跛行等，给养牛业造成巨大的经济损失。尽管使用疫苗免疫预防有一定效果，但该病仍时有发生。因此，深入研究BEFV的致病机制，包括病毒与宿主的互作，尤其是miRNA等新的研究热点，将为BEFV的防控研究提供新的靶标分子及研发线索。
　　microRNA（miRNA）是一种大小约为22bp的非编码小分子RNA，在转录后水平参与调控蛋白质编码基因的表达，对病毒感染也非常重要。宿主编码的miRNA一方面可以影响病毒的复制，并在调节抗病毒及病毒相关癌症发生等过程中发挥重要作用，另一方面又会被病毒利用，有利其复制。病毒编码的miRNA主要是由DNA病毒编码，通过调控宿主或病毒自身的基因，延长受感染细胞的寿命、逃避宿主细胞的免疫反应或者限制细胞的裂解周期等，从而有助病毒的增殖或存活。miRNA与BEFV同科的水疱性口炎病毒和狂犬病病毒的关系已有文献报道，但是BEFV与miRNA的相互作用尚未有报道。
　　首先对BEFV感染MDBK细胞12h、24h和48h的样品进行高通量测序，获得miRNA的差异表达谱。与对照样品相比，12h、24h和48h的样品，表达量上调的miRNA分别有106个、148个和90个，表达量下调的miRNA分别有208个、285个和334个，其中有19个miRNA在这三个时间点的表达都有差异显著性。对差异表达的miRNA的靶基因进行聚类分析，发现它们主要参与代谢过程和细胞过程，细胞组分为细胞和细胞部分，分子功能中最主要的是结合，主要富集的通路是翻译途径和病毒感染途径。选择其中的miR-101、miR-139和miR-2890进行实时荧光定量PCR验证，结果表明，BEFV能够下调miR-101的表达。为了验证miR-101对BEFV复制的影响，人工合成miR-101mimic，转染MDBK细胞，24小时后接种1000TCID50的BEFV。接种病毒24小时后，收获细胞样品，运用荧光定量PCR检测BEFV的RNA复制情况，并运用TCID50检测BEFV的滴度变化。与对照相比，转染miR-101mimic的细胞，病毒RNA复制降低45％，病毒滴度下降1000倍，表明miR-101能够抑制BEFV的复制。
　　对miR-101的靶基因进行预测，并对其进行聚类分析，根据靶基因的种类和分布情况以及参与的信号通路等信息，筛选mTOR、TTC3、IMPG2和SMAD2基因做为miR-101可能的候选靶基因进行验证。利用双荧光素酶报告基因系统进行检测，发现miR-101能够抑制SMAD2的表达，说明SMAD2是miR-101的靶基因之一。
　　综上所述，本研究利用高通量测序技术，首次发现BEFV调控miR-101的表达。miR-101也可以抑制BEFV的复制，并且发现它的一个靶基因为SMAD2。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

2 BEFV的基因组结构和功能

3 理化性质

4 致病机制

5 流行病学

6 诊断与防治

二、miRNA综述

2 miRNA的合成机制

3 miRNA的生物功能

4 宿主miRNA对病毒感染的调控

5 病毒miRNA(viral miRNA,vmiRA)对病毒感染的调控

三、本论文的研究内容及研究意义

第二章 miR-101与BEFV的相互作用验证

2 实验试剂

3 实验仪器

4 实验方法

二、结果

1 BEFV的TCID50测定

2 高通量筛选差异表达的miRNA

3 部分差异表达的miRNA的验证

4 miR-101在BEFV复制过程中的作用

三、讨论

四、结论

第三章 miR-101的靶基因鉴定

一、材料与方法

1 实验材料

2 实验试剂

3 实验仪器

4 实验方法

二、结果

1 miR-101的靶基因分析

2 miR-101的候选靶序列的扩增及分析

3 载体的构建和鉴定

4 miR-101与靶基因相互作用

三、讨论

四、结论

总结与创新点

参考文献

致谢