GABA能信号系统破坏肠粘膜屏障及其在溃疡性结肠炎中的作用及机制

摘要

研究目的：
　　溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis，UC)是炎症性肠病(Inflammatory boweldiseases，IBD)的一种，是一种具有慢性、反复性，危害性极大的炎症性疾病，近30年，随着我国经济文化高速发展，人们生活方式和饮食习惯的变化，UC患者数量有不断攀升的趋势，成为亟待解决的医学难题。目前UC的病因及发病机制尚不清楚，成为临床上UC研究的重点及难点。
　　GABA是一种主要存在于中枢神经系统的抑制性神经递质，广泛分布于大脑和脊髓中。目前，GABA能药物被广泛用于麻醉的诱导以及焦虑和酒精成瘾的治疗。最新研究表明:GABA能够调节免疫系统的功能， GABA能信号系统在一些自身免疫系统疾病，如1型糖尿病(Type1 diabetes，T1D)、实验性变态反应性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)、关节炎（Collagen-induced arthritis，CIA）以及皮炎的免疫治疗中发挥抑制免疫及抗炎作用。UC作为一种非特异性炎症性疾病，结肠粘膜中存在过度的炎症和免疫反应是其重要特征，因此我们推测GABA能系统激活可能在UC的发生发展中起重要的调节作用。
　　本课题中，我们主要研究GABA及GABAAR在结肠上皮中的表达、分布及其在UC发生发展中的作用及机制。我们发现GABA能信号系统激活后，破坏了结肠粘膜屏障，加重了UC的发生发展，该发现为溃疡性结肠炎的防御和治疗提供了新的视角和重要的理论依据，同时对临床GABA类药品的应用具有指导意义;此外，我们还发现GABA能信号系统激活也能够破坏正常小鼠结肠粘膜屏障，该发现对GABA类食品添加剂的应用有很大的指导意义。
　　研究方法：
　　1.动物模型制:采用6-8周c57BL/6雄性小鼠，在饮水中加入2.5％DSS，自由饮水7天，诱导急性溃疡性结肠炎，随机分成七组，分别为Control组、 DSS组、 DSS+GABA组、DSS+Muscimol组、DSS+Bicuculline组和DSS+GABA+Bicuculline组，每组六只。GABA、Muscimol和Bicuculline处理采用腹膜腔注射。
　　2.细胞模型制备:实验所用细胞为HT-29细胞（人结肠癌细胞株）和Caco-2细胞（人克隆结肠腺癌细胞）。HT-29细胞和Caco-2细胞均购自Korea CellLine Bank(Seoul，Korea)，培养条件为含10％FBS的DMEM培养基，加入青霉素和链霉素，置于二氧化碳培养箱内，5％ CO2，37℃静置培养。
　　3.动物模型检测指标:利用免疫组织化学技术检测GAD65/67及GABA AReceptor(GABAAR)β2/3在UC患者术后结肠溃疡组织及溃疡旁组织中的表达，利用Western Blotting技术检测正常及UC小鼠结肠组织中的表达;利用HE染色、CD-45免疫组化染色技术和Elisa技术检测小鼠结肠组织炎症程度;利用FITC-dextran灌胃处理检测GABA能信号系统对小鼠结肠通透性的影响;利用结肠组织细菌培养技术检测肠腔细菌入侵程度;用Using Chamber技术检测GABA能信号系统对小鼠结肠上皮屏障的影响;利用电镜，JAM-1、Occludin免疫组化及免疫荧光技术检测上皮紧密连接及紧密连接复合体蛋白在结肠中的表达情况;用PAS染色及MUC-2免疫组化染色技术检测GABA能信号系统对小鼠结肠粘液及杯状细胞的影响;用KI-67免疫组化技术检测结肠细胞增殖;用Cleaved-caspase-3免疫组化检测细胞凋亡;用QPCR技术检测Notch1、Hes1及Math1 mRNA水平研究杯状细胞分化情况。
　　4.细胞模型检测指标:利用免疫荧光和Western Blotting技术检测GABA能信号系统对Caco-2细胞JAM-1蛋白上皮屏障的影响;用QPCR技术检测GABA能信号系统对HT-29细胞MUC-1、MUC-2、MUC-5B和MUC-5ACmRNA表达的影响。
　　研究结果：
　　1.GABA A Receptor B2/3亚单位及GAD65/67在小鼠结肠组织和UC患者术后结肠溃疡旁组织中都有表达，GAD65/67主要表达于结肠隐窝细胞中，而GABAARβ2/3表达于结肠上皮隐窝及顶端成熟细胞内，在UC病人和DSS诱导的小鼠UC模型中，结肠上皮中GABAARβ2/3及GAD65/67表达明显增加。
　　2.DSS诱导的小鼠UC模型中，腹膜腔注射GABA及Muscimol后，小鼠体重下降明显，结肠变短，组织破坏加重，炎性细胞入侵明显增多，疾病活动指数(DAI)评分增加;小鼠结肠粘膜通透性增加，结肠粘膜组织内细菌数量增多;结肠黏膜跨上皮细胞电阻(TEER)降低，结肠上皮细胞紧密连接蛋白破坏加重，JAM-1及Occludin蛋白表达减少;结肠上皮PAS糖原表达量减少，MUC-2黏蛋白数目减少;结肠上皮KI-67阳性细胞数目减少;凋亡细胞数目增多。腹膜腔注射GABA A受体拮抗剂Bicuculline及同时注射GABA和Bicuculline抑制了GABA的作用。
　　3.加入GABA及GABAAR激动剂Muscimol后，Caco-2细胞JAM-1 mRNA及蛋白表达水平都明显减少;同正常对照组相比，外源加入GABA及GABAAR激动剂Muscimol后，HT-29细胞中MUC-1、MUC-2、MUC-5B以及MUC-5AC mRNA表达都明显降低;加入Bicuculline及同时加入GABA和Bicuculline后，HT-29细胞中MUC-1、MUC-2、MUC-5B以及MUC-5AC mRNA表达轻微增高。
　　4.正常小鼠腹腔注射GABA及GABAAR激动剂Muscimol后，小鼠结肠通透性增加，结肠组织内细菌数量增多;JAM-1及Occludin蛋白表达减少;结肠上皮PAS糖原表达量减少，MUC-2黏蛋白阳性细胞数目减少;结肠上皮KI-67阳性细胞数目减少。腹膜腔注射GABAAR拮抗剂Bicuculline及同时注射GABA和Bicuculline后，MUC-2黏蛋白阳性细胞数目增多;结肠上皮KI-67阳性细胞数目增多。
　　5.正常小鼠腹腔注射GABA及GABAAR激动剂Muscimol后，近端结肠MUC-2和Math1 mRNA表达量都减少，Notch1和Hes1表达增多;注射GABAAR拮抗剂Bicuculline后，逆转了这些改变。
　　研究结论：
　　1.在正常结肠上皮中存在完整的GABA能信号系统，在溃疡性结肠炎中该系统表达明显上调。
　　2.结肠上皮GABAAR激活破坏结肠粘膜屏障，加重溃疡性结肠炎的发生发展。
　　3.结肠上皮GABAAR激活通过诱导结肠上皮细胞凋亡、抑制细胞增殖，减少杯状细胞数量，破坏上皮紧密连接，导致结肠上皮粘膜屏障破坏，加重炎症反应。
　　4.结肠上皮GABAAR激活后，通过激活Notch途径抑制结肠隐窝干细胞分化为杯状细胞。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料与方法

第一部分：GABA能信号系统对小鼠溃疡性结肠炎的影响及机制

实验结果

结果讨论

附图

第二部分 上调GABA能信号系统对小鼠结肠黏膜屏障的影响及机制

实验结果

结果讨论

附图

结论

参考文献

致谢

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