组蛋白去甲基化酶KDM7家族成员PHF8和KDM7A与成人急性白血病相关性及其机制的研究

摘要

目的：
　　急性白血病根据受累细胞的不同，可分为急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia，ALL)和急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)，病情凶险，预后不佳，因此深入解析其发生机制和诊疗靶点意义重大。基于组蛋白去+甲基化的表观遗传调控异常是白血病发生发展的重要原因，PHF8和KDM7A是携带JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶KDM7家族成员，然而，其与成人急性白血病发生发展的关系及相关机制尚不清楚。本研究目的在于:
　　（一）解析组蛋白去甲基化酶PHF8介导成人ALL发生发展的功能与调控机制。
　　（二）解析组蛋白去甲基化酶KDM7A介导成人AML的功能及其作为AML诊断和预后候选标志分子的潜在价值。
　　方法与结果：
　　（一）组蛋白去甲基化酶PHF8通过与MEK/ERK信号通路相互作用促进成人ALL的发生。
　　1.PHF8在ALL中表达升高，并且与ALL的进展呈正相关:通过对GEO数据库中710例ALL骨髓样本和73例正常骨髓样本进行分析以及对17例ALL初诊骨髓样本和27例正常或缺铁性贫血骨髓样本进行检测，均发现PHF8在ALL患者中存在显著上调，说明PHF8可能参与ALL疾病的发生。对比初诊、完全缓解、复发的成人ALL患者以及对照组骨髓样本，证实PHF8的表达与ALL发生和进展呈正相关。对ALL初诊、完全缓解、复发不同时期患者PHF8蛋白水平的检测、对同一患者ALL不同疾病阶段PHF8表达水平的检测进一步验证了此结果。
　　2.稳定干扰ALL细胞中的PHF8，可以抑制细胞增殖、促进细胞凋亡，阻碍体内细胞生长:EdU和凋亡实验证明，慢病毒感染介导的PHF8稳定低表达抑制ALL细胞增殖、促进细胞凋亡。小鼠皮下成瘤模型证实PHF8稳定干扰细胞成瘤体积和重量较对照组明显降低。
　　3.PHF8在体外和体内水平上调MEK1表达:MEK/ERK信号通路是肿瘤细胞增殖、凋亡的经典调控通路。稳定干扰PHF8的ALL细胞中存在MEK1mRNA和蛋白水平的下调，伴随MEK/ERK信号通路活性的降低。ChIP实验证实PHF8可以结合在MEK1的启动子区域，从而介导MEK1的表达上调。PHF8和MEK1表达的正性相关性在191例ALL标本中同样得到了验证。此外，ALL细胞PHF8稳定干扰的小鼠皮下成瘤样本中，干扰组MEK1的mRNA水平及蛋白水平较对照组明显降低，且二者表达呈正相关，在体内水平验证了PHF8对MEK1表达的正性调控。
　　4.PD184352通过抑制MEK/ERK信号通路的活性下调PHF8的表达:PD184352是MEK/ERK信号通路的小分子抑制剂。免疫荧光结果显示，加入PD184352抑制MEK/ERK信号通路活性后，PHF8表达明显下调，证实PHF8与MEK/ERK信号通路存在正反馈调控。
　　5.干扰PHF8可增强PD184352对于ALL细胞的杀伤作用:EdU及凋亡实验证明PD184352可以抑制ALL细胞增殖、促进细胞凋亡，基于PHF8与MEK/ERK信号通路的相互调控，PHF8干扰情况下PD184352对ALL细胞系增殖的抑制和凋亡的促进明显提高，说明PHF8干扰和MEK/ERK信号通路的抑制对于ALL细胞的杀伤具有明显协同作用。
　　（二）组蛋白去甲基化酶KDM7A的低表达与AML患者的多种临床和生物学特征相关，有可能作为AML患者诊断及预后评估的潜在候选靶标分子。
　　1.AML患者存在表观遗传学谱异常:为探究表观遗传学分子在AML发生中的作用，对GEO数据库中501例AML患者和73例正常骨髓样本的429个表观遗传学基因的表达进行了差异分析，发现AML患者存在表观遗传学基因表达的广泛异常。以“差异倍数大于1.2倍、校正后P＜0.05”为界，共有111个表观遗传学基因在AML患者与对照样本中差异表达，其中71个基因表达上调，40个表达下调。显著上调基因有SMARCC1、KAT2A、ELMSAN1、DNMT3B、SMYD3等，显著下调的基因为KDM7A、KAT2B、CBX7、MYBL2、TADA2B等，其中KDM7A下调幅度最为明显，可进行更深入的研究。
　　2.KDM7A的低表达可能参与AML的发生和进展:选择KDM7A作为进一步的研究对象，对比3组相互独立的AML与对照组的骨髓或外周血样本系列的KDM7A表达，发现KDM7A在AML患者中显著下调。同时对收集的正常骨髓样本、以及AML初诊、完全缓解和复发患者的骨髓样本检测，发现KDM7A的表达与AML发生和进展呈负相关。分别对比19例和11例患者AML初诊及复发期样本，结果显示KDM7A的低表达在AML复发期更为显著，可能参与AML的疾病进展。
　　3.KDM7A的异常表达与多种AML临床及生物学特征相关:通过对数据库中KDM7A低表达组和高表达组不同临床及生物学特征进行分析，发现KDM7A的低表达与AML FAB分型、外周血及骨髓幼稚细胞比例相关，同时与许多已知的AML预测分子的表达具有相关性，如ERG、WT1、FLT3等。
　　4.KDM7A低表达可能作为AML的不良预后的潜在候选靶标分子:通过对GEO等数据库进行分析，证明KDM7A低表达的AML患者具有更短的生存期和更差的预后，在染色体核型正常的AML患者和使用法尼基转移酶抑制剂治疗的难治复发AML患者中也得到了同样的结果。
　　结论：
　　（一）证实PHF8在ALL中表达升高，与ALL的发生和进展相关。PHF8的干扰在体外水平抑制ALL细胞增殖、促进细胞凋亡，在小鼠体内阻碍ALL细胞生长。PHF8通过与MEK1启动子区域的结合转录激活其表达，从而激活MEK/ERK信号通路。小分子抑制剂PD184352抑制MEK/ERK信号通路活性后PHF8表达明显下调，阐明了PHF8与MEK/ERK信号通路间存在正反馈调控机制，而PHF8的干扰也可以增强PD184352对于ALL细胞的杀伤作用。因此，本研究阐明了PHF8在ALL中的功能及分子机制，为ALL的靶向干预提供潜在候选靶标分子以及联合治疗策略的初步线索。
　　（二）本研究证实AML患者存在表观遗传学表达谱的广泛异常，其中组蛋白去甲基化酶KDM7A下调最为明显。KDM7A的低表达与多种AML患者的临床和生物学特征相关，并提示AML患者预后不良。因此，本研究提示KDM7A可作为AML诊断、治疗、疾病进展监测及预后评估的表观遗传学潜在候选靶标分子。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 组蛋白去甲基化酶PHF8与MEK／ERK信号通路相互作用介导成人急性淋巴细胞白血病的研究

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

附录1 表格

附录2 图片

参考文献

第二部分 组蛋白去甲基化酶KDM7A与急性髓系白血病相关性及其临床价值研究

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

附录1 表格

附录2图片

参考文献

致谢

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