三邻甲苯磷酸酯诱导的Neuro-2a细胞损伤中线粒体自噬变化及其调控机制

摘要

目的：
　　三邻甲苯磷酸酯（Tri-ortho-cresylphosphate，TOCP）是工业上常用的有机磷化合物(organophosphorus compounds，OPs)，高浓度TOCP暴露可导致人类或其他敏感动物罹患迟发性神经病(organophosphate-induced delayed neuropathy，OPIDN)。OPIDN的发生是一个复杂过程，到目前为止，其确切发病机制并不清楚。轴突进行性退变是OPIDN的显著病理特征，研究TOCP诱导轴突变性的分子机制，不仅可以阐明OPIDN的发病机制，也可为发现有效的OPIDN治疗方案提供理论基础。以前的超微病理研究提示OPIDN中神经元存在异常蛋白质和受损细胞器清除障碍，可能与神经元自噬活性的改变有关。在前期工作中，本课题组建立了小鼠神经瘤母(Neuro-2a，N2a)细胞染毒模型，发现TOCP染毒可引起神经细胞系中自噬标志物LC3-Ⅱ含量明显增加，提示TOCP可引起神经细胞内自噬活性的改变。然而，细胞内自噬体含量变化的原因尚不清楚，本研究利用TOCP染毒N2a细胞建立体外模型，研究了TOCP染毒N2a细胞内线粒体自噬的变化，并探究TOCP是否通过Ca2+依赖的调控通路影响细胞自噬活性，以揭示自噬与TOCP导致的轴突退变之间的内在关系。
　　方法：
　　1.TOCP染毒N2a细胞模型建立
　　N2a细胞贴壁后给予视黄酸(retinoic acid，Ra)诱导分化，诱导分化后的N2a细胞给予TOCP染毒处理及其他干预处理。使用CCK8试剂盒测定不同浓度TOCP对分化后的N2a细胞增殖-毒性，确定TOCP染毒N2a细胞模型中TOCP使用剂量。根据细胞活性检测结果，使用0、5、10和20μM TOCP处理分化后的N2a细胞24h。N2a细胞TOCP染毒终点在显微镜下观察细胞状态，测量轴突长度。
　　2.形态学观察
　　细胞内Ca2+探针试验:在TOCP染毒处理后的N2a细胞中加入Fluo-3AM工作液使细胞内Ca2+染色并在荧光显微镜下观察。将样品细胞悬浮稀释后检测荧光强度，计算细胞内Ca2+浓度。
　　细胞内活性氧检测:使用2'7'-二氯双乙酸盐荧光探针(2'，7'-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)试剂检测细胞内生成的活性氧。装载探针的细胞样品可以用荧光显微镜直接观察，收集细胞后用酶标仪检测荧光强度。
　　细胞内线粒体探针试验:TOCP染毒后的N2a细胞使用MitoTracker染色，在荧光显微镜下观察。
　　细胞免疫荧光试验:使用免疫荧光法检测TOCP处理后N2a细胞内自噬标志蛋白LC3和线粒体自噬起始蛋白Parkin表达情况。
　　3.相关蛋白含量检测
　　蛋白免疫印迹试验（Western Blotting）:提取不同剂量TOCP染毒后和药物干预后的N2a细胞内蛋白，检测样品中LC3、P62、p-P62(S351)和Ca2+介导的自噬上游通路激酶表达水平变化。部分细胞样品提取线粒体蛋白，检测线粒体上和胞浆内PINK1-Parkin介导的线粒体自噬通路上的相关蛋白。
　　4.统计学分析:采用单因素方差分析(one-way analysis of variance，one-way ANOVA)法比较样本均数(P＜0.05)。
　　结果：
　　1.TOCP染毒对N2a细胞的影响:细胞增殖-毒性实验结果表明，TOCP浓度大于20μM时，随着TOCP浓度增加，N2a细胞活性曲线呈指数型下降，当TOCP浓度达到1000μM时，N2a细胞存活率降为零。根据细胞增殖-毒性实验结果，建立TOCP染毒N2a细胞模型，TOCP染毒浓度为0、5、10和20μM。正常情况下，N2a细胞轴突长度可达细胞胞体长轴2～3倍，TOCP染毒导致分化后的N2a细胞轴突长度明显缩短。
　　2.TOCP染毒诱导N2a细胞线粒体自噬激活:TOCP染毒导致N2a细胞内ROS浓度明显升高(P＜0.05)，提示TOCP可影响线粒体功能。Western Blotting结果表明，TOCP染毒可诱导LC3-Ⅱ、P62和p-P62(S351)在N2a细胞中表达明显增多(P＜0.05)。同时，TOCP染毒可诱导N2a细胞内线粒体自噬激活，实验结果显示Drp1、PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ、P62和p-P62(S351)向线粒体转移量明显增加(P＜0.05)，而线粒体上线粒体融合蛋白OPA1和线粒体内膜蛋白Tim23表达含量明显降低(P＜0.05)，表明TOCP可导致N2a细胞内线粒体结构异常，从而激活PINK1-Parkin介导的线粒体自噬。
　　3.TOCP诱导的自噬激活与细胞内Ca2+介导的信号通路有关:TOCP染毒导致N2a细胞内Ca2+浓度明显升高(P＜0.05)。Western Blotting结果表明CAMKKβ、p-AMPK(T172)、ULK1、p-ULK1(S317)在TOCP染毒N2a细胞中表达明显上升(P＜0.05)，并呈剂量依赖性。相反，p-mTOR(S2448)在N2a细胞中的表达显著降低（P＜0.05）。使用钙离子螯合剂BAPTA-AM处理N2a细胞，可明显抑制TOCP引起的p-AMPK(T172)和p-ULK1(S317)表达水平上升(P＜0.05)。同时，BAPTA-AM干预能降低TOCP引起的LC3-Ⅱ、P62和p-P62(S351)含量增加。结果证明，TOCP诱导的自噬激活与细胞内Ca2+浓度上升有关。
　　4.TOCP染毒N2a细胞中驱动蛋白和动力蛋白表达水平降低:试验结果显示，随着TOCP染毒剂量的增加，N2a细胞中马达蛋白kinesin和dynactin表达显著降低（P＜0.05）。
　　结论：
　　1.TOCP染毒引起小鼠神经瘤母(Neuro2a)细胞内自噬激活。
　　2.TOCP染毒导致N2a细胞内线粒体损伤，PINK1-Parkin介导的线粒体自噬起始通路激活。
　　3.TOCP诱导的N2a细胞内自噬激活与Ca2+浓度有关。TOCP染毒导致N2a细胞内Ca2+浓度显著提高，Ca2+依赖的自噬上游调控通路CAMKKβ-AMPK-mTOR-ULK1激活，而BAPTA-AM处理可明显抑制该通路激活。
　　4.TOCP染毒导致N2a细胞内马达蛋白dynactin和kinesin表达明显降低。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1．试剂与仪器

2．实验方法与步骤

实验结果

1．TOCP染毒对N2a细胞活性及轴突长度的影响

2．TOCP染毒N2a细胞内线粒体自噬的变化

3．TOCP诱导N2a细胞内Ca2+依赖的自噬上游调控通路激活

讨论

1．TOCP诱导N2a细胞内PINK1-Parkin介导的线粒体自噬激活

2．TOCP诱导的N2a细胞内自噬激活与Ca2+浓度增加有关

3．TOCP对N2a细胞中自噬过程的影响

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

综述

学位论文评阅及答辩情况表