一种新型抗新生血管生成肽的硫酸软骨素化修饰及其活性研究

摘要

硫酸软骨素(Chondroitin，CS)是一种由D-葡萄糖醛酸残基(GlacA)及N-乙酰半乳糖胺(GalNac)残基线性交替组成的糖胺聚糖，在动物的软骨组织中大量存在。由于具有较好的生物相容性及生物可降解性，这种带负电荷的糖胺聚糖常与其他药物偶联成为聚合物-药物结合物，偶联后的结合物可以增强药物的生物活性及稳定性，降低其细胞毒性，延长在体内的半衰期。另外，硫酸软骨素也是CD44受体的配体，药物与硫酸软骨素相连形成结合物后，具有潜在的主动靶向CD44受体的能力。
　　内皮抑素(Endostatin，ES)是一种内源性的多肽，分子量为20kDa，具有抗新生血管生成活性，来源于鼠血管内皮细胞瘤。ES发挥抗肿瘤作用的机制是抑制肿瘤组织附近新生血管的生成，从而切断肿瘤的营养供给途径及代谢途径。ES2（IVRRADRAAVP）是ES中的一段短肽，体内抗新生血管生成活性约为ES的三倍。
　　Anti-Flt1(AF)是一种来源于合成肽组合文库中的多肽，这种多肽可以与VEGF-R1相结合从而特异性抑制VEGF-R1与其配体相结合。通过多肽固相合成技术，将多肽ES2与多肽AF借助连接链(GGGG)相连并合成了一种新型的抗新生血管生成肽ES2-AF。然而多肽ES2-AF的生物活性受其血浆半衰期较短的因素限制，频繁给药降低了患者的顺从性并增加了治疗费用。本研究使用化学修饰的方法将硫酸软骨素与ES2-AF多肽相连，增加了多肽的稳定性及靶向CD44受体的作用。本文主要研究内容如下:
　　1.ES2-AF及CS-ES2-AF的合称及表征
　　通过固相合成的方法合成新型的多肽ES2-linker(GGGG)-AF，采用制备液相进行纯化，多肽纯度约为95.14％。质谱结果显示分子量与理论值相同。为增加CS在有机溶剂中的溶解度，采用离子交换法制备硫酸软骨素的四丁基氢氧化铵盐(CS-TBA)。在随后的制备反应过程中，借助卡特缩合试剂(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophophate castros reagent，BOP)及试剂N，N-二异丙基乙胺(N,N-diisopropylethylamine，DIPEA)的活化作用使CS-TBA与ES2-AF发生偶联反应制备CS-ES2-AF。并以一维核磁共振氢谱(1H nuclear resonance spectroscopy,1H-NMR)方式对CS-ES2-AF进行结构确证。通过1H-NMR数据的曲线下面积积分结果，确定每条CS链上平均连接2个ES2-AF多肽。
　　2.ES2-AF及CS-ES2-AF的体内外活性研究
　　(1)使用MTT法研究ES2-AF及CS-ES2-AF在体外对血管内皮细胞的抑制作用。两种药物对内皮细胞的抑制作用均呈浓度依赖性，当ES2-AF的浓度达到200μg/mL时，CS-ES2-AF表现出明显优于ES2-AF的抑制作用。
　　(2)采用划痕法研究CS-ES2-AF及ES2-AF对内皮细胞迁移的抑制作用。实验结果显示ES2-AF、CS与ES2-AF的物理混合物及CS-ES2-AF均可抑制内皮细胞的迁移运动，当ES2-AF浓度为50～200μg/mL时，结合物CS-ES2-AF的活性明显优于其他两个实验组。另外，所有实验组的抑制作用均呈浓度依赖性。
　　(3)通过体外管腔形成抑制实验评价ES2-AF、CS&ES2-AF、CS-ES2-AF抑制内皮细胞形成管腔的能力。当ES2-AF的浓度相同时，结合物CS-ES2-AF抑制内皮细胞形成管腔的作用较未经修饰的多肽ES2-AF显著提高。
　　(4)借助鸡胚绒毛膜尿囊膜实验法(Chick chorioallantoic membrane，CAM)研究ES2-AF及CS-ES2-AF在生物体内抑制新生血管生成的活性。实验结果显示，当ES2-AF浓度为10μg/mL及25μg/mL时，CS-ES2-AF的活性与ES2-AF无明显差异，;当ES2-AF浓度达到50μg/mL时，结合物CS-ES2-AF的活性才明显的强于ES2-AF。
　　3.CS-ES2-AF的靶向性研究
　　(1)使用酶联免疫法吸附测定法（ELISA法）评价药物抑制VEGF与其受体VEGF-R1结合的能力。所有实验组均有抑制VEGF与VEGF-R1受体结合的能力，且呈浓度依赖性。与ES2-AF组相比，相同浓度的CS&ES2-AF及CS-ES2-AF抑制VEGF与其受体结合的能力明显增强，且CS-ES2-AF与ES2-AF的组间差异具有统计学意义(p＜0.01)。
　　(2)采用表面等离子共振技术(Surface plasmon resonance，SPR)研究ES2-AF与CS-ES2-AF靶向CD44受体的能力。首先筛选了适宜的pH值使CD44蛋白连在CM5芯片上，当pH值为3.8时，CD44蛋白连接于芯片上产生的响应值最大，在此条件下进行偶联反应，蛋白最终偶联量为394.8RU。分别将不同浓度的样品溶液流经CM5芯片进行并对分析物与CD44蛋白之间的亲和力进行检测，测得CS-ES2-AF及ES2-AF的平衡解离常数(KD)分别为9.895×10-9及3.011×10-4。实验数据表明结合物CS-ES2-AF增强了原有多肽靶向CD44受体的能力。
　　(3)通过小动物实时活体成像技术可动态观察具有荧光标记的ES2-AF-FITC及CS-ES2-AF-FITC在荷瘤裸鼠体内的分布情况。首先使用异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)标记ES2-AF及CS-ES2-AF，并采用尾静脉注射给药的方式对荷瘤裸鼠进行给药，并通过小动物活体成像仪进行观察。相比于ES2-AF，CS-ES2-AF表现出较长的半衰期及一定的肿瘤靶向性。
　　4.ES2-AF及CS-ES2-AF的药代动力学研究
　　通过荧光酶标仪以荧光分光光度法测定ES2-AF及CS-ES2-AF的浓度，该方法符合生物样本测定方法学的要求。以腹腔注射方式分别给balb/c小鼠注射20mg/kg的药物。通过对ES2-AF及CS-ES2-AF的药代动力学参数进行分析，CS-ES2-AF组在小鼠体内的循环时间明显延长，意味着CS-ES2-AF在小鼠血浆内的稳定性优于ES2-AF。
　　在本研究中，成功制备了硫酸软骨素化的抑制新生血管生成肽结合物CS-ES2-AF，并以1H-NMR方式进行结构表征。通过一系列生物活性实验，结合物CS-ES2-AF表现出显著的生物活性，且具有主动靶向性及较长的血浆半衰期。采用硫酸软骨素修饰ES2-AF可显著增强其抗新生血管生成活性并减少给药次数，这在未来的临床应用中有良好的潜力。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一章 ES2-AF及CS-ES2-AF的合成与表征

一、实验材料

1．实验试剂

2．实验仪器

二、实验方法

1．溶液配制

2．ES2-AF的固相合成

3．ES2-AF样品的质谱分析

4．CS-TBA的合成

5．CS-TBA样品的核磁共振一维氢谱(1H-NMR)分析

7．CS-ES2-AF样品的核磁共振一维氢谱(1H-NMR)分析

三、实验结果

2．CS-TBA结合物的合成及1H-NMR谱分析

3．CS-ES2-AF结合物的合成及1H-NMR谱分析

四、讨论

2．CS-TBA结合物的合成与表征

第二章 ES2-AF及CS-ES2-AF的生物活性研究

一、实验材料

1．实验试剂

2．实验仪器

二、实验方法

1．溶液配制

2．EAhy926人源脐静脉内皮细胞的复苏、培养和传代

3．ES2-AF及CS-ES2-AF的体外抗新生血管生成活性的研究

4．CAM法研究ES2-AF及CS-ES2-AF的体内抗新生血管生成活性

三、实验结果

1．ES2-AF及CS-ES2-AF的体外抗新生血管生成活性的研究

2．ES2-AF及CS-ES2-AF的体内抗新生血管生成活性研究

四、讨论

1．ES2-AF及CS-ES2-AF的体外抗新生血管生成活性研究

2．ES2-AF及CS-ES2-AF的体内抗新生血管生成活性研究

五、本章小结

第三章 ES2-AF及CS-ES2-AF体内外结合能力的研究

一、实验材料

1．实验试剂

2．实验仪器设备

二、实验方法

1．溶液配制方法

3．表面等离子共振技术(SPR)比较ES2-AF及CS-ES2-AF两种物质在体外对细胞表面CD44受体的结合能力

4．ES2-AF及CS-ES2-AF两种物质在荷瘤裸鼠体内组织分布及靶向性研究

三、实验结果

2．CS-ES2-AF结合物在体外与CD44受体结合能力研究

3．ES2-AF及CS-ES2-AF两种物质在荷瘤裸鼠体内组织分布及靶向性研究

四、讨论

2．CS-ES2-AF在体外与CD44受体结合能力研究

3．CS-ES2-AF在体内对荷瘤裸鼠体内分布及靶向性研究

五、本章小节

第四章 ES2-AF及CS-ES2-AF在小鼠体内的药代动力学研究

一、实验材料

1．实验试剂

2．实验仪器设备

3．实验动物

二、实验方法

1．溶液配制方法

3．生物样品中ES2-AF-FITC及CS-ES2-AF-FITC的分析方法建立

4．药代动力学实验

1．标准曲线和线性范围

2．信噪比

3．日内精密度

4．日间精密度

5．方法回收率

6．体内药代动力学研究

四、讨论

2．ES2-AF-FITC与CS-ES2-AF-FITC的药代动力学

五、本章小结

第五章 全文总结

参考文献

致谢

攻读学位期间发表专利和参加科研情况