花生ω-3 FAD对提高多不饱和脂肪酸含量的研究

摘要

脂肪酸去饱和酶（fatty acid desaturase，FAD）是合成不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acid，UFA)的关键酶，它可以在饱和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)中引入单个或多个不饱和键，形成单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid，MFA)或多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)。在动物中，PUFA是机体必须脂肪酸，哺乳动物特别是人需要通过摄取外源PUFA来维持机体正常运行。在植物中，PUFA能够维持细胞膜的相对流动性，以保证细胞的正常生理功能，另外PUFA在植物应对生物与非生物胁迫方面具有重要作用。UFA及其衍生物还可以用于工业生产。PUFA可以分为ω-3PUFA和ω-6PUFA两类，其中ω-3PUFA同维生素、矿物质一样是动物体必不可少的营养物质，摄入量不足容易引起心脏和大脑等生命器官代谢障碍。花生是世界上重要的油料作物和经济作物之一，籽粒含油量在50％左右，油酸和亚油酸约占总脂肪含量的80％，UFA含量丰富，但是ω-3PUFA含量较低。随着世界对花生需求的逐年递增，提高花生产量及改善花生油品质越来越受到人们的关注。以往关于花生的研究主要集中在高产、高油酸育种方面，而对提高ω-3PUFA的研究较少。本实验从花生栽培种丰花1号(FH-1)中克隆了多个ω-3花生FAD（ω-3AhFAD）基因及其启动子，并对其进行了功能验证。主要结果如下:
　　1:AhFAD基因家族的生物信息学分析。在花生基因组中共有31个AhFAD基因，分为8类，AhSAD基因亚家族有12条序列，AhFAD2有6条序列，AhFAD3有4条序列，AhFAD4/5有3条序列，AhFAD6有2条序列，AhFAD7/8有4条序列。A基因组中有15个AhFAD，分布于8条染色体上;B基因组中有16个AhFAD，分布于7条染色体上。聚类分析显示AhFAD有两大分支:游离AhSAD分支和膜结合AhFAD分支。膜结合AhFAD分支中AhFAD4/5起源最早，ω-3AhFAD由ω-6AhFAD进化而来;单、双子叶FAD聚类于不同分支。亚细胞定位分析发现AhFAD2和AhFAD3定位于内质网上，其它AhFAD均定位于叶绿体。可变剪接分析表明，有12个AhFAD发生了可变剪接，TTS和TSS是发生最多的可变剪接事件，其次是IR，最少的是AE和ES。
　　2:ω-3AhFAD基因克隆与序列分析。根据野生花生基因组（https://www.peanutbase.org/）序列信息设计特异性引物，克隆得到7个ω-3AhFAD基因序列，其中4个AhFAD8基因(AhFAD8-1、AhFAD8-2、AhFAD8-3、AhFAD8-4)和3个AhFAD3基因(AhFAD3-1、AhFAD3-2、AhFAD3-3)。3对同源基因分别为AhFAD8-1和AhFAD8-2、AhFAD8-3和AhFAD8-4、AhFAD3-2和AhFAD3-3。AhFAD8-1有2个可变剪接异构体，AhFAD8-1.1和AhFAD8-1.2。基因CDS碱基数目在1100-1400bp不等，编码400个氨基酸左右，基因结构均含有8个外显子7个内含子。与其他植物ω-3FAD序列对比和保守结构域分析发现，除AhFAD8-1.1外，其余7个序列均具有ω-3FAD的保守结构域和3个组氨酸富集区。AhFAD8-1.1具有保守结构域，但是可变剪接造成第三个组氨酸富集区部分缺失。
　　3:ω-3AhFAD的表达模式分析。利用Taqman-PCR方法检测花生8个组织中各基因的表达水平。结果显示，该方法检测到6个基因的表达，其表达模式具有各自不同的特点。在根、茎、叶和花四个组织中，AhFAD8-1和AhFAD8-2在叶和花中的表达量高于根和茎，其中叶中最高，根中最低;AhFAD8-3和AhFAD8-4在根中的表达量最高，其次是花，在茎和叶中的表达量较低;AhFAD3-1在四个组织的表达量都较低;AhFAD3-3在花中表达量最高，叶中次之，茎和根中表达量低。在花生种子发育的四个时期（果针入土15d、30d、45d和60d），这6个ω-3AhFAD均在种子发育前期（15d和30d）表达量高，种子发育后期(45d和60d)表达量低。AhFAD8-1、AhFAD8-2和AhFAD8-3在15d的表达量明显高于30d;而AhFAD3-1和AhFAD3-3在30d的表达量高于15d;AhFAD8-4在15d和30d的表达量都比较高，二者无明显差异。
　　4:ω-3AhFAD的亚细胞定位分析。用拟南芥原生质体瞬时表达方法检测各基因的亚细胞定位情况，结果显示4个AhFAD8定位在叶绿体膜上，3个AhFAD3定位在内质网膜上。
　　5:获得ω-3AhFAD转基因酵母。成功构建真核酵母表载体pESC-URA融合质粒，将其转化酿酒酵母W303感受态细胞，并获得转基因酵母阳性菌株。
　　6:利用拟南芥遗传转化验证ω-3AhFAD功能。提取T2代纯合转基因拟南芥种子的脂肪酸进行甲酯化反应，用GC方法进行分析。结果显示，转基因拟南芥种子中几种主要脂肪酸含量增加，总脂肪酸含量升高8％-28％，亚麻酸含量平均升高2.4％，证明ω-3FAD促进ALA的合成。利用T2代转基因拟南芥株系进行抗逆性实验，结果显示，不同盐浓度下转基因拟南芥幼苗成活率比野生型提高1％-13％，且AhFAD8-3和AhFAD8-4转基因拟南芥成活率最高。
　　7:ω-3AhFAD启动子的功能验证。克隆7个基因相对应的启动子序列，其长度在1000-1500bp不等。构建GUS-植物表达载体并转化拟南芥，对转基因株系进行GUS染色。结果表明，在根、茎、叶、花、果实和种子等部位均有较强的GUS染色反应，表明这7个启动子均具有启动活性。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分：前沿综述

1 FA简介

1．1 FA从头合成途径

1．2 多不饱和脂肪酸生物合成

1．3 FA分类

1．4 PUFA的来源及功能

2 FAD研究进展

2．1 FAD分类与结构特征

2．2 FAD系统进化

2．3 植物ω-3 FAD研究进展

3 本课题研究的背景及意义

1．1 主要仪器设备

1．2 工具酶与生化试剂

1．3 菌株与质粒

1．4 植物材料

1．5 培养基及试剂配制

1．6 引物序列

2 实验方法

2．2 AhFAD生物信息学分析

2．3 AhFAD可变剪接分析

2．5 基因克隆与生物信息学分析

2．6 基因表达模式分析

2．7 亚细胞定位分析

2．8 基因功能分析

2．9 启动子的克隆与功能分析

3 结果与分析

3．1 AhFAD基因家族的生物信息学分析

3．2 ω-3 AhFAD基因克隆与功能验证

3．3 启动子活性分析

4 讨论

参考文献

致谢

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