北极海洋细菌的鉴定及PL6家族褐藻酸裂解酶的结构与催化机制研究

摘要

海洋是地球上最大的生态系统，具有低温、高压、高盐、少光照和寡营养等特征。海洋中蕴含着丰富的生物资源，微生物作为海洋生物中的重要成员，具有嗜盐或耐盐、耐高压、嗜冷、寡营养性等适应海洋环境的特性。北极海洋地区作为比较极端的海洋环境，蕴藏着与其环境相适应的具有独特性质的微生物资源，具有极大的资源开发意义与潜力。
　　褐藻是海洋生态系统中重要的初级生产力。褐藻酸是褐藻生产的主要多糖，可达到藻类生物质干重的40‰其分子是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)两种残基以多样性的排列方式由1，4-糖苷键连接而成。褐藻酸裂解酶绝大部分由海洋细菌和真菌产生，直接参与了褐藻酸的降解过程，与海洋生态系统中的有机碳循环密切相关。褐藻酸裂解酶是一种多糖裂解酶(PL)，通过β-消除机制裂解褐藻酸单体间的1，4-糖苷键，从而使得高聚物降解成一系列长短不一的寡糖链，并在产物末端六元环的C4和C5位上产生不饱和双键。目前发现的褐藻酸裂解酶分布于多糖裂解酶PL5、-6、-7、-14、-15、-17和-18家族中（http://www.cazy.org/fam/acc_PL html）。褐藻酸裂解酶用途广泛，主要用于褐藻酸结构分析、褐藻原生质体制备以及功能性褐藻寡糖的制备。此外，褐藻酸裂解酶的一些新的用途也正在开发，比如治疗铜绿假单胞菌引起的疾病，用于以褐藻为原料生产生物燃料等。因此，对褐藻酸裂解酶性质、结构和催化机制的研究，不仅有助于进一步揭示海洋中褐藻多糖的降解机制，而且可以为开发其在生物技术领域中的应用奠定基础。
　　本论文中，我们首先对从北极海洋沉积物样品中分离得到的一株疑似新种的菌株进行了鉴定，丰富了海洋微生物菌种资源库。接着，我们从实验室已进行了全基因组测序的海洋细菌中，通过对其基因组进行基因功能注释，筛选获得了PL6家族褐藻酸裂解酶基因alyGC。然后，我们对alyGC编码的蛋白AlyGC进行了序列分析和异源表达，检测了其重组酶的性质，解析了其蛋白结构，揭示了其C端结构域功能;最后，通过对其与底物复合物结构的分析和生化验证，详细阐明了以AlyGC为代表的PL6家族褐藻酸裂解酶的催化机制。
　　(1)北极细菌新种SM1214T的多相分类研究
　　北极地区是地球上的极端环境之一，也是地球微生物的资源宝库之一。然而其极端的环境条件加大了北极海洋微生物研究的难度，导致很多具有应用潜力的新的菌株资源还未被发现和利用。菌株SM1214T为本实验室自北极海洋沉积物样品中分离得到的疑似新菌种的菌株。通过多相分类学对SM1214T的形态学、生理生化、化学、分子遗传学特征进行分析，发现菌株为革兰氏阴性好氧菌，细胞呈棒状，宽约0.4-0.5μm，长约0.2-2μm;没有鞭毛，未观察到滑行(gliding)运动;菌落为圆形(直径0.5-1.5mm)，橙色凸起，表面光滑。菌株SM1214T生长温度范围为10-30℃，最适生长温度25℃;生长的NaCl范围为0.5-5％(w/v)NaCl，最适NaCl生长范围为2％;生长pH范围为6.0-8.0，最适pH为7.0。菌株具有触酶和氧化酶活性，能够水解酪蛋白和七叶苷，但不能水解DNA、弹性蛋白、淀粉或吐温80。主要的胞内脂肪酸成分为iso-C15∶0、iso-C17∶03-OH、iso-C15∶1G、C15∶0,summed feature3(C16∶1ω7c和/或iso-C15∶02-OH)、anteiso-C150和C17∶02-OH。基因组DNA的G+C含量为35.4mol％。16S rRNA基因序列分析表明该菌株与Subsaxibacter属内菌株的16S rRNA基因序列相似度最高(96.7％)，在基于16S rRNA基因序列构建的系统进化树中该菌株亦在Subsaxibacter属内形成独立的内部分枝，与Subsaxibacter属内菌株Subsaxibacter broadyi P7T成簇，表明菌株SM1214T代表拟杆菌门(Bacteroidetes)黄杆菌科(Flavobacteriaceae)Subsaxibacter属内的一个新种，立新种并命名为Subsaxibacter arcticus sp.nov.。这是该属的第二个模式种。新菌株的获得，增强了人们对北极海域海洋微生物多样性的了解，为进一步研究和开发海洋细菌及其酶资源奠定了基础。
　　(2)海洋细菌PL6家族褐藻酸裂解酶AlyGC的异源表达与性质研究
　　在褐藻酸裂解酶分布的7个多糖裂解酶家族中，对PL6家族的褐藻酸裂解酶的研究较少，且至今没有结构和催化机制的报道。海洋细菌Paraglaciecola chathamensisS18K6T是本实验室进行了全基因测序的一株细菌。我们通过对其进行基因功能注释，发现了该菌株含有可能编码PL6家族褐藻酸裂解酶的基因，我们将其命名为alyGC。我们对alyGC编码的蛋白AlyGC进行了序列分析。序列分析表明，AlyGC由两个结构域组成，包括N端催化结构域(NTD)和一个功能未知的C端结构域(CTD)。我们对去除信号肽的AIyGC进行了异源表达和纯化，并对重组酶AlyGC的生化性质进行了研究。我们发现AIyGC具有裂解褐藻酸的活性，其对聚古罗糖醛酸(PG)的降解活力最高，但不能降解聚甘露糖醛酸(PM);其催化的最适温度为30℃，最适pH为7.0，且在无NaCl条件下酶活最高;其降解产物为单糖，是一个外切酶。凝胶过滤层析和动态光散射实验结果显示，AlyGC在溶液中以二聚体形式存在。
　　(3)海洋细菌PL6家族褐藻酸裂解酶AIyGC的结构分析及其C端结构域功能的研究
　　由于PL6家族褐藻酸裂解酶的蛋白结构至今尚不清楚，这阻碍了对PL6家族褐藻酸裂解酶的功能和机制的研究。因此我们首先对AIyGC野生型和硒代甲硫氨酸标记的蛋白进行了结晶并解析了AlyGC的晶体结构。
　　在AIyGC晶体的一个不对称单元里存在四个AlyGC分子，其中两个分子的C端结构域(CTD)之间有紧密的相互作用，形成了二聚体的相互作用面。在一个AlyGC分子中，N端结构域(NTD)和CTD均采用β螺旋的折叠形式;NTD和CTD通过linker相连，形成串联的β螺旋结构。AlyGC的NTD内结合一个金属离子，经电感耦合等离子体发射光谱检测为Ca2+，形成了以Ca2+为核心的催化中心。AlyGC的CTD主体结构不参与催化腔的形成。序列分析表明CTD没有已知功能的同源序列，且在很多PL6家族褐藻酸裂解酶中都含有类似的CTD。为了揭示CTD的功能，我们对其进行了结构分析，并在此基础上进行了生化验证。结构分析显示CTD上的一个loop伸入催化腔，靠近催化中心，位于该loop上的两个氨基酸残基D631和S633距离活性中心较近。单点突变体D631A和S633A导致AlyGC酶活显著降低，而CTD的缺失突变体ACTD几乎完全丧失酶活。而且，ACTD在溶液中呈单体状态。结合结构分析和生化实验结果，我们认为CTD与维持AIyGC蛋白二聚体的形成和酶活力有关。
　　本章以海洋细菌来源的PL6褐藻酸裂解酶AlyGC为研究对象，对其晶体结构和功能未知的结构域CTD进行了研究，首次解析了PL6家族褐藻酸裂解酶的蛋白结构，并揭示了其C端结构域的功能。
　　(4)海洋细菌PL6家族褐藻酸裂解酶AlyGC的催化机制研究
　　以AIyGC为代表的PL6家族的褐藻酸裂解酶的催化机制至今未被研究清楚。为了研究AlyGC的催化机制，我们获取了AlyGC失活突变体R241A与其底物甘露糖醛酸四糖(M4)复合物(R241A-M4)的晶体，并解析了复合物的结构。R241A-M4也以二聚体形式存在。R241A-M4二体含有两个催化中心，每个催化中心都结合一个Ca2+。在R241A-M4结构中的两个活性中心仅有一个结合了底物M4，且+1位甘露糖醛酸的羧基与Ca2+有相互作用。研究结果显示，Ca2+是维持AlyGC酶活所必须的。当AlyGC中配位Ca2+的氨基酸突变或者Ca2+被EDTA螯和后，AIyGC便会丧失酶活，而当向脱辅基的AlyGC中加入Ca2+后，酶活则逐渐恢复。而且Ca2+的功能不能被其他二价金属离子，如Mg2+、Mn2+替代。R241A-M4与野生型AlyGC的结构叠加结果表明，R241A-M4二体的结构发生了明显的构象变化，结合底物的活性中心α的底物入口处变大，而无底物的活性中心β的底物入口处则显著变小（糖链无法进入）。据此，我们认为，在AlyGC催化过程中，两个催化中心的催化可能无法同时进行。在结构分析和序列比对的基础上，我们还设计了很多可能参与AlyGC催化的氨基酸残基的突变体。通过突变验证，我们鉴定出AlyGC中参与底物结合和催化的重要氨基酸残基，其中Arg241和Lys220分别是反应的催化酸和催化碱。结合以上结构分析和生化实验结果，我们最终提出了AlyGC催化褐藻酸降解的分子机制，即AlyGC采用金属离子辅助的催化机制，利用Ca2+中和底物C-5羧基的负电，Lys为催化碱，Arg为催化酸。这是对PL6家族褐藻酸裂解酶的催化机制的首次揭示。
　　本论文从海洋微生物菌种的鉴定做起，以发现获取到的海洋褐藻酸裂解酶为研究对象，详细研究了PL6家族褐藻酸裂解酶AlyGC的生化性质、晶体结构和催化机制。研究结果将丰富我们对褐藻酸裂解酶的认识，并为更好的开发利用海洋微生物资源、海洋酶资源奠定了基础。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 研究背景与立题依据

1．1 研究背景

1．1．1 海洋微生物资源

1．1．2 褐藻酸裂解酶

1．2 立题依据

1．3 研究内容

第二章 北极细菌新种SM1214T的多相分类研究

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验菌株及质粒

2．2．2 实验药品与试剂盒

2．2．3 主要仪器设备

2．2．4 数据库，分析软件与保藏中心

2．2．5 试剂和培养基配制

2．3 实验方法

2．3．1 菌株的纯化与保藏

2．3．2 表型特征鉴定

2．3．3 生理生化特性分析

2．3．4 脂肪酸组分分析

2．3．5 分子遗传学特征分析

2．4 实验结果

2．4．1 菌株的保藏

2．4．2 表型特征

2．4．3 生理生化特征

2．4．4 脂肪酸组分鉴定

2．4．5 分子遗传学特征

2．5 讨论

第三章 海洋细菌PL6家族褐藻酸裂解酶AlyGC的异源表达与性质研究

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 菌株与载体

3．2．2 主要药品和试剂盒

3．2．3 主要仪器设备

3．2．4 数据库与分析软件

3．2．5 培养基配制

3．3 实验方法

3．3．1 基因克隆与表达载体构建

3．3．2 重组蛋白的异源表达与纯化

3．3．3 蛋白浓度的测定

3．3．4 AlyGC重组酶酶学性质研究

3．3．5 蛋白在溶液中聚集形式的测定

3．4 结果与分析

3．4．1 序列分析

3．4．2 蛋白的表达与纯化

3．4．3 AlyGC酶学性质分析

3．4．4 AlyGC在溶液中的聚集形式

3．5 讨论

第四章 海洋细菌PL6家族褐藻酸裂解酶AlyGC的结构解析及其C端结构域的功能研究

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 菌株与载体

4．2．2 主要药品和试剂盒

4．2．3 主要仪器设备

4．2．4 数据库及分析软件

4．2．5 培养基配制

4．3 实验方法

4．3．1 基因克隆与表达载体构建

4．3．2 蛋白的异源表达与纯化

4．3．3 蛋白浓度的测定

4．3．4 蛋白结晶与数据收集

4．3．5 晶体结构解析与修正

4．3．6 突变体的构建

4．3．7 突变体的表达、纯化与酶活测定

4．3．9 AlyGC分子中金属离子的检测

4．3．10 圆二色谱检测

4．4 结果与分析

4．4．1 AlyGC的结晶和结构分析

4．4．2 C端结构域的功能

4．4．3 圆二色谱分析

4．5 讨论

第五章 海洋细菌PL6家族褐藻酸裂解酶AlyGC的催化机制研究

5．1 引言

5．2 材料方法

5．2．1 菌株与载体

5．2．2 主要药品和试剂盒

5．2．3 主要仪器设备

5．2．4 数据库及分析软件

5．2．5 培养基配制

5．3 实验方法

5．3．3 AlyGC分子中金属离子的螯和与回补

5．3．4 突变体的构建

5．3．5 突变体的纯化与酶活测定

5．3．6 圆二色谱分析

5．4 结果与分析

5．4．1 AlyGC的复合物结构

5．4．2 AlyGC分子中金属离子的功能分析

5．4．3 复合物结构的构象变化

5．4．4 NTD中重要氨基酸的作用

5．4．5 褐藻酸裂解酶AlyGC的催化机制

5．5 讨论

全文总结与展望

一、本论文取得的创新性成果

二、本论文的不足与下一步展望

参考文献

在读期间论文发表及专利申请情况

致谢