Burkholderia cenocepacia菌脂多糖相关O-抗原三糖重复片段及其二聚体的合成研究

摘要

在植物、微生物和动物中都广泛存在的糖是自然界中数量最多且分布最广的生物分子,是构成生物体以及储存能量不可或缺的基本物质。糖分子种类的多样性及结构的复杂性决定了糖是信息容量最大的生物分子。例如,根据细胞表面的唾液酸量能够判别癌症发生的概率,而糖的化学结构可以决定血型等。此外,细胞表面的糖链具有许多重要的生物学功能,它不仅参与了受精、生长发育、衰老和疾病的发生等生理病理过程,而且其表达的高度保守性使其成为疫苗研发的理想靶标抗原分子。
　　本论文所关注的洋葱伯克霍尔德复合菌(Burkholderia cepacia complex,Bcc)代表了一组表型相似但基因型不同的革兰氏阴性菌,在自然界和人体中有着重要的功能。一方面,Bcc的新陈代谢作用可应用于生物修复剂,其杀菌和固氮作用可增强植物的生长能力;另一方面,作为人体条件致病菌,Bcc易感染免疫力低下的人群引发临床不可控的“cepacia”综合症而引起伤口化脓,并且还会导致肺部慢性纤维化病人病情的进一步恶化,诱发肺炎和败血症。由于Bcc较强的耐药性使抗生素类药物难以根治此菌所造成的感染,需要发展新的治疗方法。
　　研究表明,裸露在细菌细胞表面的糖分子,例如脂多糖和荚膜多糖,由于其表达的高度保守性和特异性的免疫原性而成为疫苗研发的理想靶标抗原,能够诱导产生特异性免疫应答。然而,糖抗原分子的免疫原性较差,通常只诱导非T-细胞依赖型的抗体免疫反应。研究证实,将糖抗原分子与具有免疫原性的蛋白键接形成糖蛋白缀合物,并结合免疫佐剂使用,能够显著诱导产生T细胞依赖型的免疫记忆。目前,许多病原菌表面的糖分子已被开发成抗菌糖缀合物疫苗。特别是近年来,基于人工半合成和全合成策略而研发的寡糖类疫苗由于具有结构简单、质量易于控制等优点而受到科研工作者的密切关注。
　　本论文以Burkholderia cenocepacia菌脂多糖为研究对象,化学合成了其相关O-抗原的三糖重复片段及其二聚体,并将合成的寡糖片段与具有免疫活性的载体蛋白TT进行缀合制备了相应的寡糖-TT蛋白缀合物,为后续生物活性研究和相关糖疫苗的研发奠定了研究基础。本论文主要包含以下三章内容:
　　第一章总结了洋葱伯克霍尔德复合菌的研究背景、分类、致病机制和脂多糖相关O-抗原多糖重复单元的结构及其合成研究进展等。
　　第二章介绍了洋葱伯克霍尔德复合菌中致病性高的菌株Burkholderia cenocepacia菌脂多糖相关O-抗原三糖重复单元及其二聚体的化学合成。在此过程中我们运用了溶剂效应和邻基参与效应高产率的实现了糖链中α和β糖苷键构型的立体构建。首先,我们通过单糖模块4和5在inverse方法的条件下结合溶剂效应构建二糖化合物12。随后,化合物12中叠氮基团转化为乙酰氨基后脱除3位的乙酰基得到二糖受体14。二糖14和单糖供体6进行组装合成了α键接的三糖供体3。化合物3和叠氮丙基链反应得到三糖15后脱除氯乙酰基制备三糖受体16,将化合物15进行一系列脱保护后得到三糖目标分子1。接下来,我们拟通过[3+3]合成策略来构建目标分子六糖,然而我们尝试使用了不同的催化体系以及不同的三糖供体(硫苷供体3、三氯乙酰亚胺酯供体17、磷酸酯供体18),均无法得到相应目标六糖产物。我们推测可能是由于三糖受体16中鼠李糖基2,3位的苯甲酰基的吸电子效应降低了其4-OH的亲核活性。随后,我们将三糖受体鼠李糖基中2,3位羟基采用异丙叉基保护,制得三糖受体27。三糖受体27和三糖供体3进行糖苷化反应,成功构建了六糖28。最后,化合物28进行一系列脱保护基后得到目标六糖分子2。目标化合物1和2的还原端糖基含有一个游离的叠氮丙基链,将叠氮基团转化为氨基后可与免疫载体蛋白反应偶联来制备糖蛋白缀合物。本章所涉及到的所有中间体化合物和目标化合物均通过核磁与高分辨质谱对其结构的正确性进行了验证。
　　第三章介绍了Burkholderia cenocepacia菌相关寡糖-TT和BSA蛋白缀合物的制备。将上述目标化合物1和2的叠氮基团氢解还原为氨基后,通过双琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG)的活化制备得到相应单活化酯,分别与载体蛋白TT和BSA分子中赖氨酸末端的氨基进行偶联,制得Burkholderia cenocepacia菌寡糖-蛋白缀合物。上述所得糖蛋白缀合物的载糖率可根据MALDI-TOF质谱对载体蛋白缀合前后分子量的差值进行计算。所制备的糖缀合物为后续进行动物免疫实验提供了物质基础。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

1．2 洋葱伯克霍尔德复合菌的流行病学研究

1．3 洋葱伯克霍尔德复合菌的致病机制研究

1．3．1 致病基因分析

1．3．2 毒性因子的定位及功能

1．4 洋葱伯克霍尔德复合菌的分类

1．4．1 洋葱伯克霍尔德复合菌的分类方法及特点

1．4．2 洋葱伯克霍尔德复合菌重要菌种的细胞表面多糖重复单元的结构

1．5 洋葱伯克霍尔德复合菌(Bcc)脂多糖相关O-抗原多糖重复片段及其寡聚体的合成研究进展

1．6 小结

第二章 Burkholderia cenocepacia菌脂多糖相关O-抗原三糖重复片段及其二聚体的合成

2．1 引言

2．2 结果与讨论

2．3 实验部分

2．4 小结

第三章 Burkholderia cenocepacia寡糖-蛋白缀合物的合成

3．2 结果与讨论

3．3 实验步骤

3．4 小结

第四章 总结和展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文

附录