2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝中PPAr-α甲基化与炎症因子的研究

摘要

背景与目的:
　　糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种多病因的代谢疾病，以慢性高血糖为特点，伴随因胰岛素(Insulin)分泌及/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是与胰岛素抵抗、遗传易感性等密切相关的代谢应激性肝损伤，其主要病理表现是非酒精、病毒、药物引起的肝脏脂肪含量增高。2型糖尿病是血脂代谢紊乱的一种常见疾病，而脂肪肝与脂代谢密不可分，所以2型糖尿病与脂肪肝也存在一定的联系。
　　非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的发病在2型糖尿病人群中非常普遍，大约有75％的2型糖尿病病人患有脂肪肝的临床特征。而糖尿病在引起脂肪肝的病因中排第3位，仅次于饮酒与肥胖。糖尿病患者体内的葡萄糖和脂肪酸不能被很好利用，脂蛋白合成也出现障碍，致使大多数葡萄糖和脂肪酸在肝脏内转变成脂肪，沉积在肝内，导致脂肪肝。NAFLD亦可引起2型糖尿病，二者的合并存在，对患者造成严重的身体损害，对社会产生巨大的经济负担。因此深入解析2型糖尿病(T2DM)合并非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的发生发展机制，具有深远的社会意义。
　　研究表明，过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)广泛参与能量代谢的调控，PPARs有3个代表性成员:PPAR-α，PPAR-β/δ和PPAR-γ，它们在能量代谢中有着举足轻重的作用，但它们的活性表达谱不同。PPAR-α分子具有促进脂肪生成及分化、防止炎症形成、维持葡萄糖的体内动态平衡、增加胰岛素敏感性等作用，因此，PPAR-α与脂肪肝以及T2DM的发病机制之间具有相关性。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的催化作用下在胞嘧啶分子C5位上添加一个具有活性的甲基团变成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的一种化学修饰方法。PPAR-α基因的甲基化是影响代谢性疾病发生发展的一个重要因素，然而，目前尚不清楚其是否影响脂肪肝和T2DM的进展。
　　有动物实验结果显示，高脂喂养的大鼠产生肥胖后，内脏的毛细血管密度变小，血流量因此减少，脂肪细胞增生使得脂肪组织氧分压降低，从而导致脂肪组织缺氧而产生坏死与炎性浸润，浸润脂肪组织的巨噬细胞释放过量的炎性介质，如IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β1、CRP，从而引发慢性炎症反应。目前尚不清楚这些炎症因子在T2DM合并NAFLD中的水平。
　　直至今日，尚没有文献报导稳定的2型糖尿病合并NAFLD的模型，本研究中，我们构建2型糖尿病合并NAFLD大鼠动物模型，在动物模型中探索PPAR-α基因甲基化在T2DM合并NAFLD动物模型的构建过程中是否发生变化，是否影响PPAR-α蛋白的表达，并分析其甲基化水平与炎症因子IL-10、IL-6、TNF-α、TGF-β1和hs-CRP表达水平的相关性，并在临床标本中进行验证分析。
　　方法:
　　(1)通过高脂饲料加小剂量链脲佐菌素(streptozptocin，STZ)喂养雄性SD大鼠构建T2DM合并NAFLD的动物模型，观察其血脂指标总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，肝功能指标丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)以及血糖(Glu)、胰岛素(INS)水平的变化，通过HE染色评价肝脏组织的脂肪变性。
　　(2)取健康对照组和模型组动物的尾静脉全血，提取全血DNA，用DNA甲基化试剂盒测定PPAR-α基因启动子区域的甲基化水平。抽提两组动物肝脏组织总RNA，用qPCR法分析其中PPAR-α基因mRNA水平的表达情况。对两组动物肝脏组织进行蛋白质免疫印迹分析PPAR-α蛋白的表达。用酶联免疫吸附(ELISA)法检测两组动物血清中炎症因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素10（IL-10）、转化生长因子1(TGF-β1)、C反应蛋白(hs-CRP)的含量。用蛋白质免疫印迹法分析两组动物肝脏组织hs-CRP、TNF-α、IL-6和TGF-β1的蛋白表达量。
　　(3)选32例正常（N组）和35例T2DM合并NAFLD患者（M组）作为受试者，清晨8:00空腹取静脉血，生化检测血清ALT、AST、TC、TG水平。用荧光定量PCR法检测两组受试者血液中hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-10和TGF-β1的表达水平。用ELISA方法分析两组受试者血液中hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-10和TGF-β1蛋白表达量。用qPCR方法分析两组血清PPAR-α基因mRNA的表达水平。用ELISA方法分析两组血清中PPAR-α蛋白的表达水平。对两组血清中PPAR-α的表达水平与炎症因子hs-CRP、TNF-α、IL-6，IL-10和TGF-β1进行相关性分析。
　　结果:
　　(1)高脂饲料加小剂量STZ(30mg/kg)喂养雄性SD大鼠两周后，肝脏组织切片的HE染色结果显示模型组大鼠的肝细胞内部有大小不一的脂滴存在，并且呈现出了小泡性的病理性脂变。糖耐量检测结果异常。肝功能指标ALT、AST与血脂指标TC、TG水平均上升且具有统计学意义(P＜0.01);且肝质量以及肝指数水平进一步提高且要高于对照组(P＜0.01)。这些研究结果表明T2DM合并NAFLD的大鼠模型构建成功，可用于PPAR-α基因甲基化作用机制的研究。
　　(2)对健康对照组和T2DM合并NAFLD模型组大鼠PPAR-α基因的甲基化程度进行检测，结果发现健康对照组、模型组PPAR-α基因启动子区域甲基化阳性率分别为10％和65％(P＜0.05)。模型组PPAR-α的mRNA和蛋白质的表达较健康对照组均下降。与健康对照组比较，模型组hs-CRP、TNF-α、TGF-β1和IL-6水平升高，IL-10的水平降低（P值均＜0.01）。
　　(3)M组（T2DM合并NAFLD患者）受试者血清中ALT、AST、TC、TG和LDL水平较N组（正常）受试者显著升高(P＜0.01)，而HDL水平显著降低(P＜0.01)。M组受试者血清中hs-CRP、TNF-α、IL-6和TGF-β1的mRNA表达水平明显高于N组受试者（P＜0.01），而IL-10表达则明显低于N组受试者（P＜0.01）。M组受试者血清中hs-CRP、TNF-α、IL-6和TGF-β1蛋白表达明显高于N组受试者(P＜0.01)，而IL-10表达则明显低于N组受试者（P＜0.01），与RNA水平检测结果一致。M组受试者血清中PPAR-α基因的mRNA表达水平显著降低（P＜0.01）。M组受试者血清中PPAR-α蛋白表达明显低于N组受试者血清（P＜0.01）。
　　结论:
　　(1)通过病理和生化指标的分析，我们首先证实了高脂饲料加小剂量STZ(30mg/kg)可以诱发并成功构建与临床2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝一致的稳定大鼠动物模型，为该疾病发生机制和治疗方案的研究提供了工具。
　　(2)T2DM合并NAFLD大鼠PPAR-α基因甲基化百分率明显升高，血清炎性因子表达增多，可能是2型糖尿病脂肪肝发生率升高的机制之一。
　　(3)T2DM合并NAFLD患者PPAR-α蛋白表达下调，且患者的炎性因子表达异常较正常人群发生率高。在动物模型和临床血液标本中均证实，PPAR-α基因的甲基化转录调控与该疾病过程中的炎症反应的产生密切相关，提示我们PPAR-α基因的转录调控可能是控制DM合并NAFLD疾病进展的靶点之一。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 PPARs及2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝的研究进展(综述)

1．2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝的研究进展

2．PPARs与疾病的相关性

3．PPARs与非酒精性脂肪肝发生发展的相关性

4．2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝动物模型介绍

5．结论

第二章 2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝动物模型的创建

材料与方法

结果

讨论

小结

附图表

参考文献

第三章 2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝动物模型中PPAR-α基因甲基化及表达水平与炎症因子表达的初步研究

材料与方法

结果

讨论

小结

附图表

参考文献

第四章 2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝患者血液中PPAR-α的表达与炎症因子表达的初步研究

材料与方法

结果

讨论

总结

附图表

参考文献

全文总结

致谢

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