基于亚细胞器为靶点的天然产物衍生物抗肿瘤活性及作用机制的研究

摘要

癌症逐渐成为严重威胁世界各国人民身体健康的重大疾病，而且它的新发例数呈逐年上升的趋势。化疗是癌症治疗最主要的手段之一，却常因癌症本身的顽固特性而以治疗失败告终。并且化疗产生的一系列毒副作用和并发症也不同程度地影响癌症患者的生活质量。于是，科研人员一直以来致力于寻觅低毒且高效的新式靶向化疗药物。而从早期单一的细胞毒药物转向针对多个环节多种靶点的联合用药是目前研发新型抗肿瘤药物重要发展趋势。自然界中的动植物、微生物以及海洋生物一直是新药研究发展的重要源泉，从中寻找天然的抗肿瘤成分或前体药物是研发抗癌药的重要手段。其中，苔藓植物含有丰富的次生代谢产物，在抗肿瘤、抗细菌、抗真菌和昆虫拒食等多方面具有广泛的生物活性。本课题组致力于苔藓及其次级代谢产物的提取分离，结构修饰和活性发现。精准医疗的提出，目的是用先进的基础和临床研究成果，发展具有靶点选择性并能杀死癌细胞的化学疗法。许多药物的靶点也存在于亚细胞器中。深入地理解靶向不同的亚细胞器的原理能够帮助改进靶向药物的设计策略。溶酶体在肿瘤细胞中具有数量多，囊泡大，溶酶体膜更为脆弱以及组织蛋白酶活性更高等特点，这也使其成为一个抗肿瘤的良好靶点。线粒体是调控细胞存活和死亡的重要细胞器之一。不论是在结构还是功能方面，肿瘤细胞的线粒体均和正常细胞存在一些差异。近年来对于靶向亚细胞器溶酶体和线粒体的研究也成为热点。本课题就以溶酶体和线粒体为靶点研究了几个天然产物与其衍生物的抗肿瘤作用机制。
　　我们先前的研究表明，天然的大环双联苄Riccardin D的衍生物RiccardinD-N(RD-N)能够在体外富集于溶酶体并导致细胞死亡。我们通过建立来源于临床癌症病人组织的裸鼠荷瘤模型评价RD-N在体内的药效。给药25天后，取出肿瘤组织并经过免疫组化、亚细胞器分离、酶活检测和Western blotting分析。腺病毒质粒mRFP-GFP-LC3转染H460细胞用于判断自噬体的降解情况。结果证明了RD-N在体内和体外都能够诱导溶酶体膜通透。此外，我们还通过薄层色谱和鞘磷脂检测试剂盒对肿瘤组织和细胞的鞘磷脂含量进行分析，并通过底物HMU-PC检测ASM活性。借助实时荧光定量PCR，我们还检测了相关基因SMPD1的mRNA水平。结果表明，RD-N能够在体外抑制H460细胞和在体内抑制异种移植肿瘤组织的ASM活性，干扰溶酶体膜SM代谢，导致细胞溶酶体膜透化，使组织蛋白酶释放到细胞质中最终引起细胞死亡。这些结果揭示了RD-N诱导LMP的潜在机制。这为发展更有效的抗肿瘤化合物提供了一定的理论依据和思路。
　　RDD648，是本课题组一个最新经结构修饰得到的Riccardin D的衍生物，具有更强的抗肿瘤活性，尤其是在乳腺癌细胞系中。它也表现出溶酶体靶向性。机制研究发现RDD648能够诱导早期ER应激引起细胞空泡化并激活STAT3。STAT3能调控下游靶基因的转录，这些靶基因与细胞增殖、存活、转移和DNA损伤修复有关。而与在癌症中的作用相反的是，在乳腺退化过程中STAT3参与促进溶酶体途径的细胞死亡。在本研究中，我们使用了荧光染色、Western blotting、细胞组分分离和免疫共沉淀等方法，发现RDD648作用的细胞以LMP和溶酶体组织蛋白酶释放为特征，并且通过siRNA和抑制剂的使用发现在这个研究中STAT3与RDD648诱导的LM-PCD有关，因为抑制STAT3会在一定程度上减轻LMP。RDD648同时通过损伤溶酶体引起TFEB激活。两个激活的因子入核之后相互作用，但并不影响彼此表达。进一步研究发现STAT3能够部分抑制TFEB的转录调控溶酶体修复和生物合成功能。这部分的研究首次证明STAT3在乳腺癌细胞中通过与TFEB相互作用也能促进RDD648引起的LM-PCD，这一发现在未来针对STAT3高表达的癌症的治疗方案设计上具有重要意义，同时，更深入的阐明其作用机制以及如何更好的利用细胞中的这一靶点将优化未来的治疗策略。
　　二萜类化合物在大量的植物性中是抗肿瘤药物发展的重要来源，抗肿瘤活性是目前对这类化合物研究最为广泛的生物活性。甜菊苷材料易得，具有很好的潜在抗肿瘤活性的二萜骨架。本课题组对甜菊苷的酸性水解产物异甜菊醇(Isosteviol)进行结构修饰和改造得到一系列衍生物。早期的一些化合物在抗肿瘤应用方面具有选择性差和活性弱的缺点。因此，我们一方面引入抗肿瘤活性基团，提高其活性;另一方面引入靶向基团，提高其靶向性。如前文所述，溶酶体在肿瘤细胞中具有数量多、体积大和组织蛋白酶活性更强的特点，已经成为抗肿瘤靶点。利用其酸性的特点，在化合物中引入碱性基团，从而达到提高靶向性的目的。该部分研究综合应用MTT、酶活检测、免疫荧光和Western blotting等方法。经过一系列基于细胞的抗肿瘤活性筛选，我们得到活性最佳选择性最好的化合物CompdⅠ，并对其进行了抗肿瘤机制的初步研究。此外，通过联用筛选，探索了CompdⅠ与临床药物ADR的联用方案和作用机制。我们的结果表明，ADR在这里可以诱导自噬，而CompdⅠ能够破坏溶酶体抑制自噬降解过程，导致细胞中的损伤和有害的蛋白或者细胞器的进一步积累，自噬体降解受阻，最终对细胞产生致死作用，两个化合物联用具有协同效应。我们的研究为未来CompdⅠ的应用提供了一定的理论依据，更为深入的靶点机制研究也正在继续进行。
　　此外，很多分离得到的二萜类化合物能够通过靶向线粒体发挥抗肿瘤作用。肿瘤细胞的线粒体与正常的线粒体有所不同，正是这些差异为那些基于线粒体靶点的试剂指出了一种靶向肿瘤细胞的治疗策略。本课题组通过对Isosteviol进行结构修饰和改造，得到两个接有Tpp+的二萜衍生物CompdⅡ和CompdⅢ。结构修饰使它们具有很强的抗肿瘤活性，这鼓励我们对其进行进一步的机制研究。通过流式细胞仪检测ROS、线粒体膜电势和凋亡，以及Western blotting等一系列实验，证明它们能够靶向线粒体，诱导A549细胞凋亡。此外，我们将它们与临床药物syrosingopine联用试图寻找增效减毒的联用方案。Syrosingopine能够与糖酵解过程中的酶α-enolase结合从而抑制糖酵解过程，而CompdⅡ和CompdⅢ能够破坏线粒体损伤氧化磷酸化过程必不可少的线粒体电子传递链。结果如预期的那样，化合物各自在亚毒性剂量下就可杀死肿瘤细胞。联用从两个方面破坏了细胞的能量供应，因此抗肿瘤活性变得更强。我们的研究表明CompdⅡ和CompdⅢ是非常有潜力的抗肿瘤候选化合物，它们具有单独应用或者与其他靶向制剂联合应用治疗非小细胞肺癌的前景。
　　生物自显影技术在抗细菌和抗真菌方面应用得最为广泛。关于肿瘤细胞的生物自显影技术并没有得到广泛的应用。随着天然产物研究对方法的要求不断提高，快速寻找抗肿瘤化合物的需求日益增加，肿瘤细胞的生物自显影方法仍然有一定的价值和发展空间，与新技术联合应用将更加丰富这一内容。因此，我们建立了肿瘤细胞的生物自显影技术，可以在TLC板上直接找出地钱（Marchantia polymorpha）的总提物中具有抗肿瘤活性的组分或者化合物。通过联用TLC-MS，对化合物进行鉴定，最终确定了活性化合物分别是marchantin C，marchantin J和marchantin A。我们进一步通过MTT方法对它们的抗肿瘤活性进行评价，其中marchantin C效果最佳。至此，本课题研究也为课题组建立了一个快速筛选苔藓中具有抗肿瘤活性成分的方法，这在大部分相关实验室也是便捷可行的。
　　本课题的创新性及意义:
　　1.本课题首次证明RD-N在体内诱导LMP，并初步探索了其诱导LMP的机制，这与其抑制ASM活性和干扰SM代谢有关。
　　2.本课题首次揭示STAT3在乳腺癌细胞中促进了RDD648诱导的溶酶体介导的细胞死亡，并且这种作用与它和TFEB的相互作用有关，更深入地阐明作用机制及如何更好利用肿瘤细胞中的这个靶点，将可能获得一个疗效更好的治疗方法。
　　3.与临床药物Adriamycin和Syrosingopine联合应用的研究为二萜化合物CompdⅠ、CompdⅡ和CompdⅢ未来的应用提供了一定的理论基础。
　　4.肿瘤细胞生物自显影技术的探索和联用TLC-MS为本课题组建立了一个快速筛选苔藓中具有抗肿瘤活性成分的方法。

目录

声明

摘要

缩略语词汇表

前言

参考文献

第一章 Riccardin D-N体内靶向溶酶体诱导LMP机制的研究

1．2 实验材料

1．3 实验方法

1．4 实验结果

1．5 讨论

参考文献

第二章 STAT3促进RDD648诱导的乳腺癌细胞溶酶体途径的细胞死亡

2．1 引言

2．2 实验材料

2．3 实验方法

2．4 实验结果

2．5 讨论

参考文献

第三章 Isosteviol衍生物Compd Ⅰ靶向溶酶体联用阿霉素诱导肿瘤细胞死亡的机制研究

3．1 引言

3．2 实验材料

3．3 实验方法

3．4 实验结果

3．5 讨论

参考文献

第四章 Isosteviol衍生物Compd Ⅱ和Compd Ⅲ联用昔洛舍平诱导肿瘤细胞线粒体途径凋亡的研究

4．1 引言

4．2 实验材料

4．3 实验方法

4．4 实验结果

4．5 讨论

参考文献

第五章 肿瘤细胞生物自显影联用TLC-MS快速筛选抗肿瘤活性天然产物

5．1 引言

5．2 实验材料

5．3 实验方法

5．4 实验结果

5．5 讨论

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的论文