基于环境污水监测的札如病毒分子流行病学特征初步分析

摘要

感染性腹泻(Infectious diarrhea)常称作胃肠炎,是世界发病率和死亡率的第二位主要原因。急性胃肠炎(Acute gastroenteritis,AGE)始终是人口六大主要死因之一,最常见病因为胃肠道感染,以病毒最为多见。现已明确的急性胃肠炎病毒有5种:A组轮状病毒(Rotavirus)、诺如病毒(Norovirus)、肠道腺病毒(Adenovirus)、人星状病毒(Astrovirus)、札如病毒(Sapovirus,SaV)。SaV在病毒导致的散发胃肠炎中排第2至第4位。人类杯状病毒(Human Calicivirus,HuCV)包括诺如病毒和札如病毒。虽然一些动物杯状病毒已能在细胞系中增殖,但至今人类杯状病毒仍无合适的细胞培养体系。20世纪80年代PCR(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术的出现,使得HuCVs的研究达到了分子水平。SaV为无包膜单股正链RNA病毒,基因组高度变异。SaV分为至少15个基因群(Genogroups),进一步分为多种基因型。目前已知,GⅠ、GⅡ、GⅠV和GV可感染人,临床表现涵盖无症状的隐性感染,轻微的、严重的、含并发症的、脱水性腹泻甚至死亡。腹泻与医疗保健费用有关,对社会造成不容忽视的经济影响。SaV导致的AGE散发或暴发在亚洲、欧洲、非洲、北美洲、南美洲和大洋洲等地均有报道。SaV的感染剂量低,传播途径多种多样,病毒颗粒对环境有一定抵抗力,可以在全年不同场所的全年龄组人群中引起急性胃肠炎。无症状感染者常成为难以发现的暴发传染源。近年来,SaV作为公共卫生问题中的新兴角色逐渐变得为人熟知,相关暴发频现于世界各地且流行呈现增多趋势,新的基因群、基因型、变异或重组株不断涌现,而人群往往对新现病毒缺乏免疫力。目前,与AGE相关的研究并非高优先级别的,这种常见传染病还未引起公众足够的重视,人们对SaV在人群中流行状况的确切资料掌握得并不充分。这就要求在法定传染病报告系统之外,如通过腹泻症候群监测、食源疾病监测、暴发研究、环境监测等途径,获得更多病原学信息。其中,基于病毒独特外排方式的环境监测能间接获得人群中正在流行的病毒序列信息,具有敏感、代表范围广、与人群中病毒存在状况相关良好等优点可作为病例监测系统的有力补充。 研究目的： 本研究基于持续开展环境污水监测积累的标本,运用基因扩增、克隆、序列测定等分子生物学实验技术,以人SaV为研究对象开展关于基因型分布、系统进化、基因群内重组等的分子流行病学研究,主要达成以下3个目的: 1.监测环境污水中的SaV,描述并预测监测区域的基因群和基因型分布,分析遗传多样性及其随时间变化特征,同时关注新型病毒的出现及疫情流行动态; 2.分析环境污水中SaV的遗传学特征,初步探究SaV的变异与进化规律; 3.探索本研究标本与国内外其他地区临床病例或环境标本中的SaV主要流行基因型在时间、地理和系统进化上的关联。 研究方法： 1.以定时采样法,自2009年1月起每月上旬在济南、烟台市污水处理厂采集1份标本;自2013年9月起在临沂市监测点分别于每月上下旬各采集1份标本。将标本运送至实验室并采用阴离子膜吸附洗脱法进行浓缩富集。 2.提取病毒核酸后,选用巢式RT-PCR引物对组合对SaV的部分VP1区基因序列片段进行扩增,经回收纯化、TA克隆、蓝白斑筛选后,送至公司测序。 3.使用BioEdit7.0.9.0软件,将本研究获得的SaV序列与GenBank下载的参考株进行比对,计算并导出核苷酸同源性。 4.使用MEGA6.0软件以邻接法(Neighbor-joining Method)构建基于相同位置片段的含标本序列和参考株的系统进化树。 5.使用SimP1ot3.5.1软件分析基因群内重组事件和断点位置。 研究结果： 1.环境监测概况 济南、临沂、烟台市监测期分别对应为2009年1月～2016年12月、2010年4月～2016年12月、2013年9月～2016年12月,污水标本采集月份数量分别为87、68、36,共计191个月份的标本,其中,147个月份的标本中检出SaV。测序成功序列中用于结果分析的有效序列1405个,其中,非重组序列占96.2％(1352/1405),涵盖3个基因群,由多到少以依次为GⅠ.2(79.5％,1075/1352)、GⅠ.6(9.9％,134/1352)、GⅠ.1(79.5％,112/1352)、GⅡ.1(1.8％,24/1352)、GV.1(0.5％,7/1352)。除以上分型明确的序列,还发现56个两片段重组序列,1个三片段重组序列,另有1个序列未能确定所属型别。 2.污水标本中SaV基因型的地区分布 济南市标本中检出GⅠ.2(69/87)、GⅠ.Ⅰ(12/87)、GⅠ.6(9/87)、GⅡ.Ⅰ(4/87)、重组基因型(16/87);临沂市标本中检出GⅠ.2(10/46)、GⅠ.1(37/46)、GⅠ.6(18/46)、GV.1(1/46)、重组基因型(16/46);烟台市标本中检出GⅠ.2(9/36)、GⅠ.1(35/36)、GⅠ.6(9/36)、重组基因型(10/36)。 3.污水标本中SaV基因型的时间分布 监测期内,尽管个别月份未检出GⅠ.2,但GⅠ.2一直为优势基因型,其他基因型有连续数月（3～7月）的短期流行。监测末期GⅠ.2检出率与其他基因型差距缩小。济南、临沂市标本中SaV总检出率春冬略高于夏秋。3个市GⅠ.1基因型在温暖季节检出率均低于寒冷季节,而其他基因型没有观察到此规律。3个市GⅠ.6和重组基冈型在监测末期检出增多。 4.污水标本中SaV非重组序列的同源性分析 总体上,大多数GⅠ.1、G1.2、GⅠ.6型内序列在不同标本之间有较高同源性(＞97％),而GⅡ.1序列之间的同源性较低(＞95％)。监测末期(2015～2016),年度内GⅠ.6序列之间的同源性与往年相比有小幅下降。相同标本和不同标本中可见100％同源的序列。逐年基因型内核苷酸同源性数值区间有些波动。 5.污水标本中SaV常见基因型的系统进化分析 不同时期3个市检出的GⅠ.1、GⅠ.2、GⅠ.6序列亲缘关系密切,且与世界其他地区的许多分离株有较近的亲缘关系,多为日本分离株。GⅠ.1和GⅠ.2进化树中未发现病毒变异与采样日期或地点之间存在关联。GⅠ.6进化树中,采样日期为2015～2016年间的一些序列呈现时间聚类。 6.污水标本中重组序列的同源性比较、系统进化分析和SimPlot相似曲线 虽然重组片段与标本内部序列（当可获得时）同源性普遍高于与外部参考株的同源性,但两者均不乏与重组片段100％同源的毒株。分段系统进化树显示,重组断点前后序列分别与不同基因型的毒株聚集成簇。SimPlot绘制的相似曲线清晰地呈现了断点位置和重组类型。以上结果相互呼应,共同为新型GⅠ群内重组事件和不常见的断点位置提供了证据。 研究结论： 1.预计监测区域内长期存在的GⅠ.2将仍为未来一段时期内的优势基冈型,伴随GⅠ.1和GⅠ.6相继短期流行。GⅠ.6型在监测期末（2015～2016年）检出率呈升高趋势,序列间同源性与往年相比有所下降,部分序列呈现时间聚类,或预示该型内新变异株的产生。 2.在3种常见基因型中,仅观察到GⅠ.Ⅰ型有季节趋势,即寒冷季节检出多于温暖季节。至于此规律是否为GⅠ.Ⅰ型固有,有待于积累更充足的监测数据后进行统计学分析,并在后续监测中观察季节规律是否继续存在。 3.不同国家或地区流行着亲缘关系相近的GⅠ.1和GⅠ.2,本研究与世界其他地区GⅠ.1和GⅠ.2序列高度相似,可能来自同一来源。稀少基因型GⅡ.1和GV.1可能与不同地域间的人员流通有关,应警惕稀少基因型被输入后逐渐与区域内宿主适应甚至引起广泛流行的风险。 4.自监测首年（2009年）起出现GⅠ群内重组基冈型,在监测期末（2015～2016年）检出增多。经序列分析,共发现6种类型基因型间重组,另有1序列为三片段重组,重组位点均位于RdRp-VP1折叠区域外的保守区,以往均未见报道。 5.SaV可能通过隐匿传播途径导致人群中的隐匿暴发。人群中SaV的流行资料还十分有限,需要各地实验室开展环境监测以积累更多可比较的数据。

目录

声明

摘要

英文缩略词说明

1研究背景

1．1札如病毒相关的分子生物学研究进展

1．2札如病毒相关的人类疾病研究进展

1．3札如病毒监测研究进展

2研究目的与意义

2．1本研究的目的

2．2本研究的意义

3本研究的技术路线

1．1标本来源

1．2主要试剂与耗材

1．3主要仪器设备

1．4主要软件

2实验方法

2．1环境污水标本采集与浓缩

2．2核酸提取、基因扩增及序列测定

3札如病毒VP1部分基因序列的分析

3．1序列整理与型别鉴定

3．2序列的同源性分析

3．3序列的系统进化分析

3．4序列的重组分析

4质量控制

4．2其他相关步骤质量控制

结果

1环境污水标本中检出SaV基因型的地理、时间分布

1．1三市污水标本中SaV基因型检出概况

1．2济南市污水标本中检出SaV基因型的时间分布

1．3临沂市污水标本中检出SaV基因型的时间分布

1．4烟台市污水标本中检出SaV基因型的时间分布

1．5污水标本中主要基因型在寒冷／温暖季节的检出差异

2环境污水标本中SaV序列的同源性分析

2．1污水标本中SaV非重组基因型序列的同源性分析

2．2污水标本中SaV两片段重组序列的同源性分析

2．3污水标本中SaV三片段重组序列的同源性分析

3环境污水标本中SaV序列的系统进化分析

3．1污水标本中常见基因型代表序列的系统进化分析

3．2污水标本中稀少基因型代表序列的系统进化分析

3．3基因群内两片段重组序列的分段系统进化分析

3．4基因群内三片段重组序列的分段系统进化分析

4环境污水标本中重组基因型代表序列的重组分析

4．1 GI．I+GI．2重组序列的相似曲线分析

4．2 GI．2+GI．1重组序列的相似曲线分析

4．3 GI．I+GI．6重组序列的相似曲线分析

4．4 GI．6+GI．1重组序列的相似曲线分析

4．5 GI．2+GI．6重组序列的相似曲线分析

4．6 GI．6+GI．2重组序列的相似曲线分析

4．7 GI．2+GI．I+GI．2重组序列的相似曲线分析

讨论

本研究的主要先进性和不足

结论

附录

参考文献

致谢

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