TBX20基因启动子区甲基化在法洛四联症中的致病机制研究

摘要

先天性心脏病(CHD)是最常见的出生缺陷之一，包括一系列的心血管畸形。目前认为是CHD患者的遗传因素和其相关的环境因素共同作用的结果。心脏发育是一个精细的过程，与心脏发育相关的基因表达都受到精细的调控。除了基因序列的变异可以导致基因表达水平改变外，环境因素通过表观遗传学机制在基因表达调控方面的重要作用受到越来越多的重视。表观遗传学(Epigenetics)机制包括甲基化修饰、微小RNA调控及组蛋白修饰等。其中甲基化修饰是目前研究最多的表观遗传学现象。DNA甲基化是最常见的基因表观修饰方式之一。它主要是指通过DNA甲基转移酶将S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到DNA胞嘧啶的5'位，形成5-甲基胞嘧啶。这种DNA修饰方式并没有改变基因的序列，但是它可以调控基因的表达、维护染色体的完整性、调节DNA重组及某些基因的转录活性。 启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并控制基因转录的起始和表达程度。启动子对基因转录水平的调控主要表现为顺式作用元件、反式作用因子及RNA聚合酶三者之间的相互协同作用，其本质为DNA与蛋白质、蛋白质与蛋白质之间的相互作用。启动子区序列的变异可以通过影响转录因子等反式作用因子与顺式作用元件的结合而导致基因转录水平的变化。除了序列的变化，越来越多的研究表明基因启动子区DNA甲基化水平的改变能够调控基因的转录水平。启动子区CpG岛甲基化增高将影响基因的转录，进而抑制基因的表达及功能，而去甲基化则诱导基因的重新活化和表达。甲基化和去甲基化主要通过直接和间接两种机制控制基因的表达。直接机制是指CpG岛甲基化直接通过抑制RNA聚合酶活性或干扰某些转录因子与基因调控区的结合而抑制基因的表达。间接机制主要包括两种类型:1.基因启动子调控序列甲基化后与甲基化CpG结合蛋白结合，阻止该基因与其它转录因子形成转录复合物;2.基因启动子区DNA甲基化后通过改变染色质的结构进而阻碍基因DNA与转录因子结合。 以往的研究表明，转录因子、信号分子、细胞粘附分子及离子通道分子是参与心脏发育的最主要有四类分子。其中，目前研究最多的是转录因子，包括锌指家族、同源结构域家族、T-box(TBX)家族、基本螺旋-环-螺旋和MADS区域家族等。转录因子是指能与核酸特异性序列相结合的蛋白质，通过识别和结合基因启动子区域的顺式作用元件从而调控基因的表达。转录因子作用于下游基因的同时也同时受上游诱导信号的调节，它们构成一个复杂而精确的网络对心脏的发育起重要的调节作用。 T-box家族属发育调控相关转录因子家族，通过其特有的T-BOX区域参与多种生物的发育调控。T-box家族均具有一个大的DNA结合域T-BOX，与其结合的所有DNA序列都存在一致性序列TCACACCT即T半位点，因此编码该蛋白的基因称为T-box基因。T-box基因家族分为5个不同的亚家族，其中主要与心脏发育相关的有TBX1亚家族的TBX1、TBX18、TBX20及TBX2亚家族的TBX2、TBX3和TBX5。它们通过协同和竞争机制在心脏的发育过程中起着重要的作用。 法洛四联症(TOF)是最常见的紫绀型先心病，约占先天性心脏病的10％，是胚胎时期圆锥动脉干发育异常所致，肺动脉狭窄、室间隔缺损、主动脉骑跨和右心室肥厚是其主要的病理特征。法洛四联症患儿自然预后不佳，若未及时诊治大多在成年期前死于慢性缺氧导致的继发性心肌肥大和心力衰竭。即使手术纠治仍有少部分患儿因术后心律失常等并发症而发生猝死。法洛四联症作为临床最常见的圆锥动脉干畸形，部分患者存在染色体及基因的突变，但目前还没有明确致病基因的报道。目前认为与法洛四联症相关的基因有NKX2.5、TBX20、CX43、TBX1、GATA4、FOG2、TBX5、HIRA等。 TBX20的全称为T-box20，定位于7号染色体的短臂14区2带，属于转录因子TBX家族的TBX1亚家族。通过对小鼠胚胎的研究显示TBX20在心脏成环早期的心内膜垫有很强的表达，在后期的流出道、房室管及房间隔中隔前缘等心内膜垫结构的表达更加显著。目前TBX20是T-box家族发现的唯一可以在心内膜垫稳定和广泛表达的成员。而心内膜垫的异常发育可以导致多种先天性心脏病的发生，包括大动脉转位、右室双出道、法洛四联症、房室间隔缺损等。因此，TBX20基因是人类圆锥动脉干畸形候选基因之一。 TBX2基因定位于染色体17q23，它在胚胎发育的各种组织和器官中广泛表达。TBX2异常表达小鼠常伴有流出道间隔缺损及心腔特异性基因的异常表达。以往的研究表明，TBX20可以促进心腔心肌特异性基因的表达而抑制TBX2的表达，对心腔心肌的增殖和分化起着至关重要的研究。Cai等认为BMP2是TBX20在房室管发育中的关键下游基因之一，他们认为TBX20不仅直接抑制TBX2的表达，而且通过BMP2信号通路间接促进了TBX2的表达。 先前的研究表明TBX20突变仅发生于少部分先天性心脏病患儿中，TBX20序列的改变并不能完全解释它在先天性心脏病中的致病作用。目前，对人类相关基因的甲基化研究主要集中在肿瘤组织中，而DNA甲基化在先天性心脏病中的致病作用研究甚少。 研究目的： 1.检测法洛四联症患儿右室流出道心肌组织TBX20基因启动子区甲基化水平及TBX20基因mRNA及蛋白的表达。探讨TBX20基因启动子甲基化水平与TBX20基因表达的关系。 2.检测TBX20基因相关因子TBX2及BMP2在法洛四联症患儿心肌组织的mRNA及蛋白表达。探讨TBX20与TBX2和BMP2之间的关系，并揭示它们在法洛四联症中的致病作用。 3.探讨TBX20基因启动子区甲基化在法洛四联症的致病作用，为研究TBX20基因在法洛四联症的致病机制提出新的研究模式，进一步为先天性心脏病围产期筛查提供理论依据。 研究方法： 1.利用NCBI网站查找TBX20启动子转录起始点上游2000bp及下游1000bp的序列。采用Methyl Primer Express Software v1.0查找TBX20基因启动子区CpG岛分布情况。利用Neural Network Promoter Prediction查看TBX20基因核心启动子序列。利用JASPAR软件预测TBX20基因CpG岛区与其它转录因子的结合位点。 2.选取23例法洛四联症患儿及5例意外死亡儿童的心脏右室流出道心肌组织为研究对象。采用重亚硫酸盐PCR测序方法检测TBX20基因启动子区的甲基化水平。采用荧光定量PCR检测TBX20基因及其相关因子TBX2、BMP2的mRNA表达。通过蛋白质印迹实验检测TBX20基因及其相关因子TBX2、BMP2的蛋白表达。 3.统计分析:采用SPSS22.0及GraphPad prism v5软件分析数据。正态分布数据以均值±标准差表示，非正态分布数据以中位数及四分位数表示。TBX20基因启动子区甲基化水平、mRNA及蛋白相对表达的正态数据采用t检验，非正态数据采用Mann-Whitney检验。采用Spearman检验TBX20与mRNA是否具有相关性，P＜0.05为差异有统计学意义。 研究结果： 1.利用生物信息学网站及软件分析TBX20基因启动子(-400bp～-48bp)位于CpG岛内。该区域共含42个CpG位点，预测该区域含有多个转录因子结合位点(TFAP2、GATA5及TBX1/2/4/5等)。 2.法洛四联症组TBX20基因启动子区（-400bp～-48bp）总体甲基化水平较对照组降低(P=0.035)。在42个CpG位点中，法洛四联症组第26CpG位点甲基化水平较对照组降低(P=0.016)。其余位点两组间差异无统计学意义。 3.法洛四联症组右室流出道心肌组织TBX20基因mRNA表达较对照组明显增高（P＜0.001)，差异有统计学意义。法洛四联症组右室流出道心肌组织TBX20启动子区（-400bp～-48bp）甲基化水平与其mRNA表达水平成负相关，r=0.81，P＜0.001。法洛四联症组右室流出道心肌组织TBX20蛋白表达较对照组增高(P=0.008)，差异有统计学意义。 4.法洛四联症组右室流出道心肌组织TBX2基因mRNA表达低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.001)。法洛四联症组右室流出道心肌组织BMP2基因mRNA表达与对照组相比无明显差异(P=0.082)。 5.TBX2蛋白在法洛四联症组右室流出道心肌组织的表达低于对照组，差异有统计学意义(P=0.022)。法洛四联症组右室流出道心肌组织BMP2蛋白的表达与对照组相比差异无统计学意义(P=0.537)。 研究结论： 1.TBX20基因启动子区（-400bp～-48bp）含有多个转录调节元件，该区域甲基化的降低可能影响了TBX20基因启动子与TFAP2C的结合进而造成TBX20基因mRNA及蛋白表达增高。 2.TBX20基因表达增高可以抑制TBX2基因mRNA及蛋白的表达。TBX20及TBX2基因的表达异常均可以导致心脏的发育异常，这可能是法洛四联症的致病机制之一。 3.TBX20基因启动子区的甲基化水平异常可能在法洛四联症发病中起重要作用。本研究为进一步探索TBX20基因在法洛四联症中的致病机制提出了新的研究模式，同时为先天性心脏病的围产期筛查提供了新的理论依据。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分TBX20基因在法洛四联症患者心肌组织中甲基化及表达差异的研究

前言

资料和方法

结果

讨论

结论

第二部分TBX20基因相关因子TBX2及BMP2在TOF患者心肌组织的表达研究

前言

资料和方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

攻读学位期间的学术成果

学位论文评审及答辩情况表

文献综述 T-box家族与先天性心脏病的研究进展

英语文章Ⅰ

英语文章Ⅱ