自噬在调节髓系白血病糖酵解中的作用及其机制研究

摘要

目的: 髓系白血病(myeloid leukemia)是一种造血系统恶性增殖性疾病，近年来随着对疾病的病因学、发病机制认识的提高以及靶向治疗药物的研发和应用，髓系白血病患者的生存期获得了有效的延长。但是由于肿瘤细胞对化疗药物耐药性的存在，髓系白血病仍然有着较高的致死率。因此需要寻找新的治疗靶点以增加药物的疗效，提高患者生存率。 自噬是通过溶酶体降解细胞内老化的蛋白质或病损细胞器的过程，并且自噬可以利用降解产物提供能量和重建细胞结构来维持内环境的稳定。自噬相关蛋白(autophagy-related protein，ATG)是重要的自噬组成蛋白，其中自噬相关蛋白7(autophagy-related protein7，ATG7)作为自噬泡形成的关键分子，是自噬现象检测和评价的重要指标。自噬在髓系白血病发生发展中的作用尚不明确。一方面，自噬可以维持造血干细胞的正常供能，促进正常的髓系分化，起到抗肿瘤的作用;另一方面也有研究表明化疗耐药的髓系白血病细胞株的自噬水平高于普通细胞株，在耐药的白血病细胞中，自噬可以提高细胞增殖水平，从而对肿瘤起着促进作用。因此，自噬在髓系白血病发生发展中的作用需要进一步研究。 糖酵解是肿瘤细胞的主要供能方式，Warburg效应指出即使在氧气充足条件下肿瘤细胞仍以糖酵解为主要的产能方式，且糖酵解关键酶如葡萄糖转运蛋白(glucose transporter1，GLUT1)、已糖激酶(Hexokinase2，HK-Ⅱ)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase A，LDHA)在这一过程中发挥重要作用。目前自噬对肿瘤糖酵解的作用研究取得了一定进展，有研究表明在肝癌及卵巢癌中，自噬抑制后可以导致糖酵解水平减低，提高化疗药物的敏感性。然而，在髓系白血病中，自噬是否能够通过对糖酵解的调节来改变化疗药物的敏感性尚未阐明。 Wnt/β-catenin信号通道是生长发育过程中的关键信号系统，这一信号通路不仅可以在调节细胞的增殖、分化等生理功能方面发挥作用，而且其异常激活与多种恶性肿瘤的发生发展有关。在肝细胞肝癌及结肠癌中Wnt/β-catenin信号通路上调可以提高糖酵解水平。有研究指出在髓系白血病中存在着Wnt/β-catenin信号通路的异常激活，那么Wnt/β-catenin信号通路是否与自噬相关，以及是否在自噬对糖酵解的调节中发挥作用尚未见报道。 有鉴于此，本研究通过检测ATG7在髓系白血病患者中的表达水平，评价自噬在疾病预后中的意义及其与糖酵解的相关性;通过探究在髓系白血病细胞中ATG7水平改变对糖酵解的调控作用，评价自噬对化疗敏感性的影响。同时，本研究将探讨Wnt/β-catenin信号通路在自噬对髓系白血病糖酵解调控过程中所起到的作用，为寻找髓系白血病可能的耐药机制和新的治疗靶点提供理论依据。 方法: 1.临床标本的收集及检测:收集初次确诊的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者及正常对照骨髓样本，RT-PCR、Western blot分别检测ATG7、GLUT1、HK-Ⅱ及LDHA水平。 2.糖酵解抑制实验:对髓系白血病HL-60细胞株及K562细胞株分别应用糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose，2-DG)后，应用CCK-8检测细胞增殖水平改变，同时应用2-DG及阿糖胞苷(cytarabine，Ara-c)后采用流式细胞术AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡水平。 3.自噬抑制对髓系白血病细胞株糖酵解作用 (1)慢病毒转染:采用sh RNA技术使ATG7基因沉默，应用荧光显微镜及流式细胞术确定细胞的转染效率，并应用RT-PCR及Western Blot检测ATG7的抑制率。 (2)应用Western Blot检测P62及LC3B水平来确定自噬水平的改变。 (3)细胞增殖和凋亡检测:在自噬抑制后，应用CCK-8检测细胞增殖水平，流式细胞术检测应用Ara-c后细胞凋亡水平。 (4)在自噬抑制后，己糖激酶法测定葡萄糖水平，乳酸氧化酶法测定乳酸水平。 (5)应用RT-PCR及Western Blot检测自噬抑制前后GLUT1、HK-Ⅱ及LDHA水平。 4.自噬激活对髓系白血病细胞株糖酵解作用 培养基中加入自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin，Rap)以激活自噬。应用Western Blot检测P62及LC3B水平来确定自噬水平的改变。在自噬激活后，应用CCK-8检测细胞增殖水平，流式细胞术检测应用Ara-c后细胞凋亡水平，并检测葡萄糖消耗及乳酸产生改变。应用RT-PCR及Western Blot检测自噬激活前后GLUT1、HK-Ⅱ及LDHA水平。 5.自噬水平改变对β-catenin水平的影响 应用RT-PCR及Western Blot检测自噬水平改变时β-catenin水平的改变。 6.siβ-catenin慢病毒转染效果评估 慢病毒转染:采用si RNA技术使β-catenin基因沉默，应用荧光显微镜及流式细胞术确定细胞的转染效率，并用RT-PCR及Western Blot方法检测β-catenin的抑制率。 7.自噬激活后β-catenin基因沉默的HL-60细胞及K562细胞的糖酵解水平改变 (1)在β-catenin基因沉默的HL-60细胞及K562细胞中加入Rap后，应用Western Blot检测P62及LC3B水平来确定自噬水平的改变。 (2)己糖激酶法测定葡萄糖水平，乳酸氧化酶法测定乳酸水平。 结果: 1.AML组较正常对照组的ATG7水平在mRNA水平及蛋白水平均增高，完全缓解组较未完全缓解组ATG7水平减低。以ATG7的mRNA水平的中位数为界值，将所有AML患者分为ATG7基因高表达组和低表达组。对AML患者的临床资料进行分析，ATG7的mRNA水平与AML患者的年龄、性别、白细胞水平无明显相关性，而与AML患者的缓解情况相关。HK-Ⅱ、GLUT1及LDHA在mRNA水平及蛋白水平均表现为AML组较正常对照组增高，且HK-Ⅱ、GLUT1及LDHA与ATG7具有相关性。提示ATG7水平可能与AML的预后及糖酵解水平相关。 2.应用糖酵解抑制剂2-DG后分别在0h，8h，16h，24h检测HL-60细胞株及K562细胞株葡萄糖的消耗以及乳酸的产生。结果显示加入2-DG组的葡萄糖消耗及乳酸产生明显减少，细胞株增殖减少，对Ara-c敏感性提高，说明通过抑制糖酵解可以提高髓系白血病细胞株的化疗敏感性。 3.应用sh ATG7慢病毒使HL-60细胞株及K562细胞株ATG7基因沉默，HL-60细胞株的转染效率达到79.6％，K562细胞株的转染效率为77.9％。并应用RT-PCR及Western Blot技术验证ATG7水平受到抑制，自噬受到抑制。进一步研究发现自噬抑制后，髓系白血病细胞株的增殖水平减低，对Ara-c的敏感性提高，糖酵解水平受到抑制，糖酵解关键酶水平降低。以上结果说明，在髓系白血病细胞中，可以通过ATG7基因沉默抑制自噬，从而降低糖酵解关键酶水平，抑制糖酵解，提高化疗药物敏感性。 4.应用自噬激活剂Rap后应用Western Blot检测P62及LC3B水平确定自噬激活。进一步研究发现自噬激活可使髓系白血病细胞株的增殖加强，使细胞对对Ara-c的耐药性提高，提高糖酵解水平，提高糖酵解关键酶水平。 结论: 1.AML患者中ATG7水平与预后及HK-Ⅱ、GLUT1和LDHA水平相关，提示在AML患者中自噬水平与患者的预后及糖酵解水平有关。 2.在HL-60及K562细胞株中，应用Rap激活自噬可以使髓系白血病糖酵解的关键酶HK-Ⅱ、GLUT1及LDHA表达上调，从而促进糖酵解，降低对化疗药物的敏感性;通过ATG7基因沉默抑制自噬可以使HK-Ⅱ、GLUT1和LDHA水平下调，糖酵解受到抑制，从而提高化疗药物的敏感性。表明自噬可以通过对糖酵解关键酶的调控对髓系白血病糖酵解发挥作用。 3.自噬抑制可以使Wnt/β-catenin信号通路水平下调，自噬激活可以使Wnt/β-catenin信号通路激活。β-catenin基因沉默可以使自噬提高HK-Ⅱ、GLUT1和LDHA水平及糖酵解的作用减弱。由此说明，自噬对髓系白血病糖酵解的作用可能是通过Wnt/β-catenin信号通路介导的。 创新性及意义: 1.本研究证实，在髓系白血病患者中ATG7与预后不良有关，在髓系白血病细胞中自噬通过对糖酵解关键酶的调控影响糖酵解水平，并且该作用和髓系白血病细胞的耐药性密切相关;进而提出，可以通过降低ATG7水平抑制自噬来提高髓系白血病细胞对化疗药物的敏感性，提高治疗效果。ATG7可能成为髓系白血病新的生物标志物，为提高髓系白血病的疗效提供了新的治疗策略。 2.本研究首次提出自噬对糖酵解关键酶的调控作用是通过Wnt/β-catenin信号通路介导的，为进一步探讨自噬对髓系白血病细胞糖酵解作用的分子机制奠定了基础，亦为寻找髓系白血病新的治疗靶点提供了理论研究。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 自噬在髓系白血病糖酵解中的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图(表)

参考文献

第二部分 自噬通过Wnt／β-catenin信号通路调节髓系白血病糖酵解的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图(表)

参考文献

综述

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