维生素B6对肺炎球菌脑膜炎大鼠的脑保护作用及其机制

摘要

背景和目的: 肺炎球菌脑膜炎是最常见的中枢神经系统感染性疾病之一，在世界范围内具有较高的病死率，且存活者发生远期后遗症的风险较高，尽管有效的抗菌治疗，仍有大约1/3的幸存者留有长期的后遗症，如听力丧失、脑麻痹、癫痫、脑积水以及认知障碍等，且肺炎球菌所致脑膜炎发生至少1种后遗症的平均概率为24.7％。因此，在积极给予合理抗生素抗感染及应用肾上腺皮质激素等治疗的基础上，研究肺炎球菌脑膜炎的病理生理机制，寻找新的辅助治疗肺炎球菌脑膜炎的方法，有助于改善肺炎球菌脑膜炎的预后。 近年来研究证实，肺炎链球菌性脑膜炎可以引起两个病理生理不同形式的脑损伤，即海马细胞凋亡和皮质坏死。海马结构的损害与学习和记忆障碍有关。肺炎球菌感染的炎症介质能够诱导免疫反应和通过犬尿氨酸(KYN)途径引起色氨酸退化。犬尿氨酸是色氨酸最为重要的中间代谢产物之一，通过犬尿氨酸氨基转移酶的作用可被代谢为犬尿喹啉酸(KYNA)。KYNA是一种中枢神经系统兴奋性氨基酸受体的广泛拮抗剂，是避免兴奋性氨基酸损伤脑组织及神经系统的有效保护因子，具有抗惊厥、抗痉挛以及保护神经系统等作用，尽管KYNA具有神经保护作用，但如果中枢神经系统中KYNA的积累超过正常生理水平，就会导致谷氨酸功能减退，进而导致认知功能障碍。另有研究报道，在肺炎球菌脑膜炎中，KYN通路能够影响烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)在神经组织的生成。且肺炎球菌脑膜炎时，兴奋性氨基酸谷氨酸等释放增加。维生素B6是两个关键酶KYN转氨酶和犬尿氨酸酶的辅助因子。因此理论上维生素B6催化参与色氨酸的代谢反应，在肺炎球菌脑膜炎中能够通过对KYN、KYNA的影响，减少犬尿氨酸途径产生的神经毒性产物，及增加NAD、ATP表达，以减弱神经细胞的死亡，起到脑保护作用。为了证实这一假设，建立幼龄大鼠肺炎链球菌性脑膜炎模型，研究维生素B6治疗对大鼠表现，对大鼠脑组织KYN、KYNA、NAD、ATP表达的影响，对炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10表达的影响，对脑组织犬尿氨酸羟化酶(KMO)表达的影响及对脑组织病理学的影响;同时应用KMO抑制剂Ro-61-8048，观察其对上述指标表达的影响以及对脑膜炎大鼠脑损害程度的影响，以探讨维生素B6对肺炎球菌脑膜炎的脑保护作用及其机制。 方法: 1.研究对象:将出生21天的Wistar大鼠90只随机分为四组:36h组(n=30)，3d组(n=20)，7d组(n=20)，14d组(n=20)。36h组(n=30)分为6组:正常对照对照组、脑膜炎模型组、头孢曲松组、头孢曲松+维生素B6组、头孢曲松+Ro-61-8048组、头孢曲松+维生素B6+Ro-61-8048组，每组5只。3d组、7d组和14d组各自分为4组:正常对照组、脑膜炎模型组、头孢曲松组、头孢曲松+维生素B6组，每组5只。36h组需要完善临床观察，KYN、KYNA、NAD、ATP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的测定，及KMO表达的检测。3d组、7d组仅观察临床表现，14d组除了观察临床表现外，还需进行Morris水迷宫行为测试。 2.幼鼠肺炎球菌脑膜炎的诱导:正常对照组之外的其余70只大鼠参照Leib的方法，将动物用1％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后，小脑延髓池穿刺，通过32-gauge针直接注入10ul含有(1×106cfu/ml)肺炎链球菌(血清型(3))的盐水，制备脑膜炎模型。正常对照组注入10ul生理盐水。造模18h后大鼠麻醉，从小脑延髓池取脑脊液，于绵羊血琼脂糖培养基行细菌培养以确定造模成功。 3.给药:注入细菌感染的同时，需要注入维生素B6的大鼠，开始给予腹腔内注射360ul维生素B6(600mg/kg，sc)，其余大鼠给予腹腔内注射360ul0.85％NaCl。接种细菌18小时后，抽取5ul的脑脊液定量培养记录感染，需要给予头孢曲松治疗的大鼠，开始给予头孢曲松(100mg/kg，sc)，余给予生理盐水治疗，同时维生素B6治疗的大鼠给予第2次治疗(600mg/kg，sc)。之后头孢曲松及维生素B6每日用药1次，36h组、3d组及7d组用药维持至动物实验结束预处理前，14d组用药至感染后7天停药。需要注入Ro-61-8048的大鼠，分别于感染18h和24h给予腹腔内注射Ro-61-8048（100mg/kg，sc，以59mg/ml溶于DMSO）。 4.临床观察: (1)不同时间段各组观察临床表现，根据症状，给予评分。1分:昏迷;2分:仰卧位不能直立;3分:30s内直立;4分:活动行走稍减少，＜5s内直立;5分:正常。 (2)对14d组中于感染第10d开始各组大鼠进行Morris水迷宫行为测试以观察对大鼠的空间学习记忆能力的影响，为期4天，计算出每天各组大鼠每次到达平台的平均时间。 5.组织处理:各组动物实验预结束后，深麻醉，处死，之后立即左心灌注30毫升的冰冷的磷酸缓冲盐(PBS)，剥离脑组织，分为左侧半球和右侧半球。左侧鼠脑迅速放入-80℃冰箱中备用，以用于ELISA及Western blot法的检测。右侧鼠脑用于做病理学观察和免疫组化，用4％多聚甲醛灌注后，再用4％多聚甲醛固定1-3天，常规进行脱水、浸蜡和包埋，以备用。 6.检测方法:KYN、KYNA、NAD、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的测定采用酶联免疫吸附法（ELISA法），ATP的检测采用ATP含量试剂盒及分光光度仪进行，操作严格按照说明书进行。KMO蛋白水平的检测采用Western blot法，依次经过蛋白提取、SDS-PAGE电泳、电转膜、抗原抗体反应及显色等步骤，KMO的定量采用凝胶成像分析系统进行半定量分析。KMO基因转录水平的测定采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法，经过总RNA提取、cDNA的合成、定量PCR及结果处理等步骤。KMO mRNA的定量采用扩增系数的方法表示。脑组织病理学检查方法，将蜡块切成5um厚切片，行HE染色，显微镜下观察大鼠脑膜的病理改变。KMO在鼠脑的免疫组化染色经过抗原修复，清除内源性过氧化物酶，山羊血清封闭，滴加一抗、二抗，及显色、复染、脱水、封片等步骤。 7.统计学处理:实验结果所得的计量资料以均数±标准差表示，应用SPSS17.0软件进行统计学处理。采用单向方差分析(ANOVA)来比较差异。P＜0.05为差异有统计学意义。 结果: 1.接种肺炎链球菌后的大鼠，抽取脑脊液培养，证实与接种的为同株肺炎链球菌且有较高的细菌浓度。正常对照组的大鼠脑脊液无细菌生长。 2.临床结果观察:感染脑膜炎大鼠均可表现为精神差、活动少、进食少，症状评分明显减少，且重者可表现为转圈、偏瘫等。头孢曲松+维生素B6治疗脑膜炎较单纯头孢曲松治疗更能改善脑膜炎大鼠的临床表现。另Ro-61-8048能够使脑膜炎大鼠的临床表现进一步加重。 3.Morris水迷宫行为测试:头孢曲松组寻找平台时间为19.6±2.1秒，头孢曲松+维生素B6组寻找平台时间为14.6±1.1秒。经t检验显示(P＜0.05)，说明头孢曲松+维生素B6组寻找平台时间较头孢曲松组明显缩短。 4.KYN、KYNA、NAD、ATP的表达:36h组中，与正常对照组比较，脑膜炎模型组KYN、KYNA明显升高(P＜0.05)，头孢曲松组较脑膜炎模型组KYN、KYNA减低，头孢曲松+维生素B6组较头孢曲松组KYN、KYNA明显减低(P＜0.05)。但头孢曲松+Ro-61-8048组KYN、KYNA较头孢曲松组增多(P＜0.05)，头孢曲松+维生素B6+Ro-61-8048组KYN、KYNA亦比头孢曲松+维生素B6组增多(P＜0.05)。NAD、ATP浓度变化则与KYN、KYNA相反。 结论: 1.小脑延髓池内注入1×106cfu/ml的肺炎链球菌悬液，能够成功制备脑膜炎模型。 2.维生素B6辅助治疗肺炎球菌性脑膜炎能够改善脑膜炎大鼠的临床表现、空间学习记忆能力及脑组织的病理损害。 3.在肺炎球菌性脑膜炎中，KMO的表达无论是蛋白水平、基因转录水平还是免疫组化方面均明显增高，KMO抑制剂Ro-61-8048的应用能够降低KMO的表达，但却增加了脑膜炎损害的程度，考虑与过度增加的KYN、KYNA的表达，及减少NAD、ATP的表达有关。维生素B6则能够通过减少KMO的表达，发挥其对脑细胞的保护作用。说明犬尿氨酸通路参与肺炎球菌性脑膜炎的病理生理机制。 4.维生素B6能够通过调节犬尿氨酸代谢物的水平及炎症细胞因子的水平，在肺炎球菌性脑膜炎中发挥脑保护作用。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分犬尿氨酸途径代谢物在肺炎球菌脑膜炎中的表达及在认知障碍中的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

第二部分维生素B6对肺炎球菌脑膜炎大鼠的脑保护作用及其机制

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

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