IL--33在呼吸道合胞病毒感染SD幼鼠气道炎症中的作用研究

摘要

目的: 呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）属于副粘病毒科，肺炎病毒属，是婴幼儿最常见下呼吸道感染病原体，多数感染发生在1岁以内，几乎所有儿童在2岁前都曾遭受过RSV感染。全世界每年新发5岁以下儿童RSV感染毛细支气管炎、肺炎约3400～6400万例，约造成5～20万儿童死亡，严重危害儿童健康，是婴儿期死亡的重要原因之一。儿童RSV感染后发生反复喘息，甚至以后发生哮喘的几率也增加。因无特效抗RSV药物，临床治疗RSV毛细支气管炎多采用综合治疗，以对症支持疗法为主。目前尚缺乏安全有效的RSV疫苗。 本研究首先进行体外细胞培养，探索RSV感染大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞IL-33表达释放的规律。继而用滴鼻法建立RSV感染SD幼鼠模型，测定RSV感染SD幼鼠肺泡灌洗液中IL-33浓度及肺组织IL-33mRNA的表达量。通过对RSV感染SD幼鼠应用抗IL-33中和抗体处理，观察处理后实验动物肺组织病理切片，收集BALF进行细胞计数、分类，测定其血浆中Th1类细胞因子IFN-γ及Th2类细胞因子IL-5、IL-13，并检测肺组织ST2、P-ERK1/2、P-JNK、P-p38和P-p65-NF-κB的蛋白表达量，探讨IL-33抗体在RSV感染气道炎症中的作用机制，为临床诊治RSV感染毛细支气管炎提供新的思路。 方法: 1.细胞培养利用Hela细胞培养制备RSV A病毒悬液并调定病毒滴度。复苏培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)，收集RSV病毒感染大鼠AECⅡ后3h、12h、24h细胞培养上清液，ELISA测定IL-33的浓度;提取AECⅡ细胞RNA，实时荧光定量PCR测定AECⅡ在RSV感染3h、12h、24h时IL-33 mRNA的表达。 2.动物实验3～4周龄SPF级雄性SD大鼠随机分为4组，空白对照组、RSV感染组、RSV+抗-IL-33组、RSV+IgG组，每组10只。利用滴鼻法，连续2d在每侧鼻孔内滴入0.5μl/g滴度为5×104TCID50/0.1 ml的RSV病毒悬液，建立RSV感染SD幼鼠动物模型。空白对照组SD幼鼠，鼻孔内滴入无病毒培养基，作为阴性对照。RSV+抗-IL-33组，RSV病毒悬液首次滴鼻前3h及第2次滴鼻后12h，分2次，分别给予抗-IL-33中和抗体鼻腔内滴入作为治疗。RSV+IgG组，给予IgG经鼻腔内滴入作为治疗对照。实验第4d处死所有SD幼鼠。留取肺组织标本，对RSV感染SD幼鼠肺组织大体标本及HE染色病理切片进行观察，并收集BALF进行细胞计数、分类。ELISA测定SD幼鼠血浆中Th1和Th2类细胞因子IFN-γ、IL-5、IL-13及肺泡灌洗液中IL-33浓度。采用实时荧光定量PCR检测肺组织IL-33mRNA和ST2mRNA的表达量，应用Western blot检测肺组织ST2、P-ERK1/2、P-JNK、P-p38和P-p65-NF-κ B的蛋白表达量。 结果: 1.RSV感染大鼠AECⅡ细胞IL-33mRNA及细胞培养上清液中IL-33的测定RSV感染大鼠AECⅡ IL-33mRNA的相对表达量较同一时间点对照组明显增高，P＜0.05，差别有显著统计学意义。RSV感染大鼠AECⅡ上清液IL-33浓度较同一时间点对照组明显增高，P＜0.05，差别有显著统计学意义。 2.RSV感染后SD幼鼠肺组织大体标本肉眼观空白对照组肺组织大体标本呈淡粉色，表面光滑。RSV感染组和IgG处理组肺组织充血均明显，可见不规则的充血区及广泛散在的出血点。IL-33抗体处理组，病变较轻，肺大体标本可见散在少许充血区。 3.肺组织HE染色病理切片空白对照组肺组织结构清晰，支气管粘膜上皮完整，肺泡壁光滑。与对照组比较，RSV感染组及IgG处理组SD幼鼠支气管粘膜上皮结构紊乱，粘膜下层增厚，细支气管上皮细胞坏死，管腔狭窄，肺组织有大量淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞及嗜酸粒细胞浸润，肺泡壁增厚、肿胀。RSV+IL-33抗体处理组，病变较轻，少量炎性细胞浸润，上皮细胞病变坏死较轻，粘膜下层轻度增厚，肺泡壁略增厚。 4.气道炎症半定量评分RSV+抗-IL-33组气道炎症评分低于RSV感染组和RSV+IgG组，但高于空白对照组，差别均有统计学意义(P＜0.05)。RSV感染组与RSV+IgG组间气道炎症评分无显著差别。 5.血浆细胞因子的测定与空白对照组相比，RSV感染组、RSV+抗-IL-33组、RSV+IgG组SD幼鼠的血中IL-5、IL-13及IFN-γ水平均增高。RSV+抗-IL-33组IL-5、IL-13水平低于RSV感染组以及RSV+IgG组，P＜0.05，差别均有统计学意义;IL-5、IL-13在RSV感染组与RSV+IgG组间差别无显著统计学意义。IFN-γ水平在RSV感染组、RSV+抗-IL-33组、RSV+IgG组均高于空白对照组，P＜0.05，差别有统计学意义;在RSV感染组、RSV+抗-IL-33组、RSV+IgG组间的两两比较差别均无统计学意义。IFN-γ/IL-5比值，在RSV感染组、RSV+抗-IL-33组以及RSV+IgG组比值均低于空白对照组，P＜0.05，差别有统计学意义;RSV+抗-IL-33组IFN-γ/IL-5比值高于RSV感染组以及RSV+IgG组，P＜0.05，差别有统计学意义;RSV感染组与RSV+IgG组间IFN-γ/IL-5比值差别无显著统计学意义。 6.肺泡灌洗液IL-33及肺组织IL-33mRNA的测定与空白对照组比较，RSV感染组SD幼鼠肺泡灌洗液中IL-33浓度增加，P＜0.05，差别有显著统计学意义。RSV感染组SD幼鼠肺组织中IL-33mRNA的相对表达量较空白对照组明显增高，差别有显著统计学意义 7.BALF细胞计数及分类与空白对照组相比，RSV感染组、RSV+抗-IL-33组、RSV+IgG组SD幼鼠BALF中炎性细胞均较空白对照组增多。RSV+抗-IL-33组BALF中炎性细胞的计数低于RSV感染组以及RSV+IgG组，P＜0.05，差别均有统计学意义;BALF中炎性细胞的计数在RSV感染组与RSV+IgG组间差别无显著统计学意义。BALF中细胞分类的比较显示:RSV+抗-IL-33组BALF中淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞的比例均低于RSV感染组以及RSV+IgG组，P＜0.05，差别均有统计学意义;在RSV感染组与RSV+IgG组间BALF淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞比例差别无显著统计学意义。RSV感染组、RSV+抗-IL-33组、RSV+IgG组SD幼鼠的BALF中巨噬细胞比例均低于空白对照组，RSV+抗-IL-33组BALF中巨噬细胞比例高于RSV感染组以及RSV+IgG组，P＜0.05，差别均有统计学意义;在RSV感染组与RSV+IgG组间BALF中巨噬细胞比例差别无显著统计学意义。 8.肺组织ST2mRNA及ST2的蛋白相对表达量肺组织ST2mRNA及ST2蛋白的表达量在RSV感染组、RSV+抗-IL-33组、RSV+IgG组均高于空白对照组;而在RSV+抗-IL-33组低于RSV感染组及RSV+IgG组，P＜0.05，差别均有显著统计学意义。肺组织ST2mRNA及ST2蛋白的表达量在RSV感染组和RSV+IgG组间差别无统计学意义。 9.肺组织中MAPK蛋白的相对表达量肺组织P-ERK1/2相对表达量各组间差别无统计学意义(P＞0.05)。肺组织P-JNK及P-p38蛋白的表达量在RSV感染组、RSV+抗-IL-33组、RSV+IgG组均明显高于空白对照组;而在RSV+抗-IL-33组则低于RSV感染组及RSV+IgG组，P值均＜0.05，差别有显著统计学意义。肺组织P-JNK、P-p38蛋白的表达量在单纯RSV感染组和RSV+IgG组间差别无统计学意义。 10.肺组织中NF-κB蛋白的相对表达量肺组织P-p65-NF-κB蛋白的表达量在RSV感染组、RSV+抗IL-33组、RSV+IgG组均明显高于空白对照组;而在RSV+抗-IL-33组则低于RSV感染组及RSV+IgG组，P＜0.05，均有显著统计学差别。肺组织P-p65-NF-κB蛋白的表达量在RSV感染组和RSV+IgG组间差别无统计学意义。 结论: 1.RSV诱导大鼠ACEⅡ IL-33表达上调。 2.RSV感染SD幼鼠模型肺组织IL-33表达增加。 3.IL-33作为一种前炎症性细胞因子在RSV感染SD幼鼠的气道炎症中通过IL-33/ST2通路，活化JNK、P38信号通路及NF-κB，导致Th2类细胞因子IL-5、IL-13的表达增加，促使机体的免疫状态发生Th2偏移，促进气道炎症反应。 4.IL-33中和抗体治疗通过封闭IL-33，下调ST2表达，阻断IL-33/ST2通路，减轻JNK、P38信号通路及NF-κB的活化，抑制机体Th2偏移，发挥减轻RSV感染SD幼鼠气道炎症反应的作用。

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声明

摘要

符号说明

前言

第一部分呼吸道合胞病毒诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞IL-33表达增加

实验材料和方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

第二部分IL-33在呼吸道合胞病毒感染SD幼鼠气道炎症中的作用研究

实验材料和方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

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