褪黑素通过Notch1/Numb/Snail信号通路调控子宫内膜相关疾病上皮间质转化的研究

摘要

子宫腺肌病是指有活性的子宫内膜腺体和间质出现在子宫肌层中。同子宫内膜异位症相似，它的主要症状是痛经、月经异常及妊娠率下降等，给生育期的女性带来极大的身体和经济负担。子宫内膜异位症的发病率大约为10％，是一种常见的呈雌激素依赖的妇科良性疾病。其主要特征是有活性的子宫内膜组织出现在子宫内膜以外的位置，常引起盆腔疼痛、不孕等症状。高复发率是子宫内膜异位症的特点之一。近年来，有越来越多的研究开始关注于如何减轻子宫内膜异位症的临床症状及预防该病复发。子宫内膜癌是一种世界上最常见的女性生殖道恶性肿瘤，常见于围绝经期及绝经后妇女。由于环境的影响，子宫内膜癌的发病率呈逐年上升趋势。其中来源于子宫内膜上皮的子宫内膜样腺癌大约占85％-90％。大多数子宫内膜癌早期即可发现症状，70％的患者可在Ⅰ期被发现，首选手术治疗。对于发展到Ⅲ-Ⅳ期的患者，手术联合放疗或化疗是主要的治疗方法。综上所述，子宫内膜相关疾病严重影响着女性的生殖健康，因此对于其发病因素的探究具有十分重要的意义。 Notch信号通路在进化上高度保守，是决定细胞命运的重要通路之一。此外，Notch通路还参与调控细胞的分化、增殖及凋亡等过程，也是参与调控上皮间质转化的关键信号通路。Notch信号级联通路主要由四部分组成，包括4种Notch受体、5种Notch配体、CSL-DNA结合蛋白及下游靶基因。CBF-1/RBPκ-J介导的信号通路被认为是经典的Notch信号通路。Notch信号通路在哺乳动物体内的激活通常需要以下三个步骤:Notch受体在S1位点被碱性蛋白酶裂解为ECN小体和TM小体，在胞内产生成熟的异源二聚体受体;受体与配体结合后，引发构象改变后暴露S2位点，从而进一步被一系列金属蛋白酶裂解;γ-蛋白酶复合物作用于S3位点，导致受体胞内段(NICD)的裂解和释放，继而进入细胞核中调节下游靶分子，包括与上皮间质转化相关的基因Snail和Slug，启动细胞内信息传递。目前已有大量研究对转录因子Snail1和Snail2(Slug)抑制E-cadherin蛋白生成的机制进行了探索。但是，Notch信号通路在子宫内膜异位症及内膜癌发病机制中的影响尚未明确。 上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指细胞从具有紧密连接、极性和缺乏活动力的上皮细胞表型转化为细胞间连接松散、无极性和活动力强的间充质细胞表型的过程，在胚胎发育、组织再生以及癌症的迁移、侵袭等过程中发挥着重要的作用。一系列的转录因子被证明参与启动EMT进程，比如Snai1、Slug、Zeb1/2、Twist等。EMT过程的标志特征是存在上皮相关蛋白E-cadherin的降解和间质相关蛋白N-cadherin、Vimentin等表达的升高，并伴随细胞迁移和侵袭能力的增强。 褪黑素(N-乙酰-5-羟色胺)主要是由松果体腺体以色氨酸为原料合成并分泌的一种胺类激素，在视网膜中也检测到有少量分泌，最初被发现其主要功能是抗辐射及抗氧化。褪黑素最具代表性的特点是具有昼夜节律性，能够对光线产生反应。大量体内、体外研究证明它可作为体内激素、神经传导递质和抗氧化剂对人体多种疾病产生潜在的治疗作用，比如调节生理节律，促进深度睡眠，抗氧化及调节免疫等。褪黑素对于子宫内膜异位症的抑制和治疗作用已在小鼠动物实验中得到了证实，其治疗后能引起异位病灶的萎缩。亦有研究证明褪黑素通过MMP3介导的凋亡相关通路对内异症发挥作用。另外，褪黑素在多种肿瘤疾病的研究中表现出了抑制EMT的作用。但是，褪黑素通过Notch通路调节子宫内膜异位症及子宫内膜癌中17β-雌二醇介导的EMT目前尚未报道。 第一部分 Notch1/Numb/Snail信号通路在子宫腺肌病中的表达 目的:子宫腺肌病是指有活性的子宫内膜腺体和间质侵入到子宫肌层而引起的弥漫性或局限性病变。可引起痛经、月经量异常和女性生育力下降等症状，是育龄期女性的常见病、多发病，严重影响了女性的身体健康和生活质量。上皮间质转化(EMT)是子宫腺肌病的发病机制之一，而Notch通路是调控EMT的关键信号通路之一。本研究的目的是探索Notch1/Numb/Snail信号通路相关指标在子宫腺肌病中的表达情况。 方法:正常子宫内膜取自45例经手术后组织病理学证实内膜无病变的患者（其中增生期患者:n=15;分泌期患者:n=15;绝经期患者:n=15）。子宫腺肌病异位内膜病灶取自30例经子宫全部切除或部分切除手术后组织病理学证实为子宫腺肌病的患者（其中增生期患者:n=15;分泌期患者:n=15）。收集正常子宫内膜和子宫腺肌病异位内膜组织标本，通过免疫组织化学方法检测Notch1/Numb/Snail级联信号通路以及EMT相关指标的表达。 结果:发现与正常子宫内膜相比，Notch1和EMT的相关蛋白N-cadherin、Snail和Slug在子宫腺肌病异位内膜中的表达上调;而Numb作为Notch信号通路的负调控因子，在子宫腺肌病中的表达显著下调。同时，E-cadherin蛋白在子宫腺肌病中的表达降低。 结论:Notch1/Numb/Snail信号通路在子宫腺肌病中表达异常，可能在此病的发生发展中发挥重要作用。本研究为子宫腺肌病的诊断和治疗提供了新的思路。 第二部分 褪黑素抑制子宫内膜异位症和正常子宫内膜细胞中17β-雌二醇诱导的增殖、迁移和EMT 目的:子宫内膜异位症是具有转移和侵袭的恶性生物学表现的良性疾病。褪黑素是治疗子宫内膜异位症的一种潜在药物，但是其中涉及到的分子机制仍不明确。本研究中，探索了褪黑素对子宫内膜异位症腺上皮细胞EMT的影响，并进一步探索了其中可能涉及到的信号通路。 方法:本研究采用了60名生育期妇女的子宫内膜组织用于免疫组织化学分析，检测正常子宫内膜组织和子宫内膜异位症在位内膜组织中Notch1/Numb信号通路和EMT相关指标的表达情况。将6例子宫内膜正常的患者及6例子宫内膜异位症患者的在位子宫内膜进行腺上皮细胞原代分离培养。采用CCK-8方法检测了雌激素、褪黑素及Notch通路抑制剂对正常子宫内膜异位症在位内膜腺上皮细胞增殖的影响。采用Transwell实验方法检测了雌激素、褪黑素及Notch通路抑制剂对正常和子宫内膜异位症在位内膜腺上皮细胞迁移、侵袭的影响。采用Western blot方法检测了雌激素、褪黑素及Notch通路抑制剂对子宫内膜异位症在位内膜腺上皮细胞中Notch1/Numb信号通路和EMT相关指标的表达情况。 结果:与正常子宫内膜相比，子宫内膜异位症在位内膜组织中Notch1，Slug，Snail和N-cadherin蛋白的表达水平显著升高，而E-cadherin和Numb蛋白表达水平则呈现降低趋势。褪黑素及Notch通路特异性抑制剂显著抑制了正常和子宫内膜异位症在位内膜腺上皮细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT相关指标的表达。 结论:异常的Notch1/Numb信号通路及其EMT存在于子宫内膜异位症中。褪黑素通过上调Numb的表达和下调Notch1通路的活性来抑制17β-雌二醇诱导的上皮间质转化。 第三部分 褪黑素通过Notch/Numb信号通路抑制子宫内膜癌中17β-雌二醇诱导的EMT 目的:子宫内膜癌是发生于子宫内膜的女性生殖系统常见恶性肿瘤之一，但是褪黑素与子宫内膜癌及Notch/Numb信号通路的相关研究尚未见报道。本研究中，研究了褪黑素对子宫内膜癌Ishikawa(ISK)和KLE细胞中EMT的影响，并进一步探索了其中可能涉及到的机制。 方法:使用褪黑素、Notch通路抑制剂及雌激素分别处理ISK和KLE细胞后，采用CCK8检测了细胞的增殖，采用Transwell实验方法检测了细胞迁移、侵袭，采用Western Blot方法检测ISK细胞中Notch1/Numb信号通路和EMT相关指标的影响。构建靶向沉默Numb基因慢病毒载体，并转染ISK和KLE细胞，得到Numb敲除ISK和KLE细胞系，应用CCK8实验检测转染后ISK和KLE细胞的增殖能力，应用Transwell检测两种细胞的迁移、侵袭能力变化，应用划痕实验检测转染后ISK细胞的迁移能力。 结果:褪黑素及Notch通路特异性抑制剂显著抑制了ISK和KLE细胞的增殖、迁移和侵袭，促进了细胞的凋亡。在子宫内膜癌ISK细胞中，Notch1、Slug和Vimentin蛋白的表达升高，E-cadherin和Numb蛋白的表达降低。褪黑素和Notch通路抑制剂能够抑制ISK细胞中EMT相关指标的表达。敲除与未敲除Numb相比，ISK和KLE细胞的增殖、迁移及侵袭能力显著增强。 结论:褪黑素能够通过上调Numb的表达和下调Notch1通路的活性来抑制子宫内膜癌ISK细胞中17β-雌二醇诱导的上皮间质转化。Numb表达缺失能够加速子宫内膜癌细胞的增殖、转移及侵袭。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分Notch1/Numb/Snail信号通路在子宫腺肌病中的表达

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

第二章褪黑素抑制子宫内膜异位症和正常子宫内膜细胞中17β-雌二醇诱导的增殖、迁移和EMT

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

第三章褪黑素通过Notch/Numb信号通路抑制子宫内膜癌中17β-雌二醇诱导的EMT

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

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