羟基喜树碱的层状氢氧化物杂化复合体及聚乙二醇偶联物的合成、表征及性能

摘要

10-羟基喜树碱（10-hydroxycamptothecin，简称HCPT）是一种非离子型疏水性抗肿瘤药物，具良好的抗癌活性，但因水溶性差、分子结构不稳定（活性内酯环结构在碱性介质中水解形成非活性羧酸盐型结构）和毒副作用大等问题而影响其临床应用效果。研制HCPT控释体系如“无机纳米杂化物”和“水溶性聚合物偶联物前体药”等是提高其疗效的有效途径。 层状金属氢氧化物(Layered metal hydroxides，LMHs)，包括层状双氢氧化物(Layered double hydroxides，LDHs)和层状氢氧化物盐(Layered hydroxide salts，LHSs)，是近期备受关注的新型药物载体。药物分子可插入其层间形成药物-LMH纳米杂化物，达成对药物的有效控释，被认为是一类极具应用潜能的药物输送-控释体系。但存在两个亟待解决的问题:其一，非离子型疏水性药物插层（负载）困难，而绝大多数抗癌药物是非离子型疏水性的;其二，药物-LMH纳米杂化物在水介质中分散性极差，聚集很严重，限制其临床应用。探索研究提高非离子型疏水性药物负载量以及改善药物-LMH纳米杂化物水分散稳定性的方法和技术，对LMH基药物输送-控释体系的研发具有重要意义。 水溶性聚合物偶联疏水性药物构建双亲性前体药(Amphiphilic prodmgs)是近期研究热点之一，已发现其在水介质中的自组装体结构与其药效密切相关。但目前对其自组装行为认识还很肤浅，特别是报道的自组装体多为纳米粒（或胶束），只有一篇报道涉及囊泡结构（实际上所报道的很多纳米粒可能具有囊泡结构，只是未深入探究其结构而简单归为纳米粒），而囊泡膜结构因与细胞膜结构相似，故作为药物输送体系具独特优势。合成新的双亲性前体药物分子，系统考察其自组装行为，探究其自组装体结构特别是囊泡结构形成的可能性，阐释其构效关系等，是一个具重要意义的研究课题。 本文以HCPT为非离子疏水性药物模型，以Mg-Al LDHs和氢氧化锌硝酸盐LHSs为LMHs载体，采用“阴离子胶束增溶药物”（可称“药物修饰”）结合“共组装”或“共沉淀”法，制备了HCPT插层LMHs(HCPT-LMH)纳米杂化物，考察了其载药量，以探索实现HCPT有效负载的方法和技术;采用脂质体(Liposomes，LSs)包覆修饰HCPT-LMH纳米杂化物制备了纳米复合物，记为(HCPT-LMH)@LS，考察了其水分散稳定性，以探索改善纳米杂化物水分散稳定性的有效路线。以聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)为亲水性聚合物模型，通过酯化反应合成了PEG偶联HCPT前体药物(PEG-bi(COO-HCPT))，系统考察了其表面活性、聚集行为和药物释放行为等，特别是探究了其自组装体结构，以期加深对双亲性前体药物聚集行为的认识，为高效前体药物的研制提供依据。采用细胞试验对所制备的载药体系细胞毒性进行了初步评价，以探讨其构效关系，考察其临床应用前景。 本文主要研究内容和结论: (1)HCPT插层LDHs纳米杂化物的制备、修饰、表征及性能 采用“药物修饰”结合“共组装”法制备了HCPT插层Mg3Al-NO3LDHs纳米杂化物。先把HCPT增溶到阴离子活性物胆酸钠(Sodium cholate，Ch)胶束中，再与预先剥离的Mg3Al-NO3LDH单层纳米片(Single-layer nanosheets)共组装，制备了HCPT插层LDHs纳米杂化物，记为HCPT-Ch-LDH。对其化学组成、晶体结构及形貌等进行表征。以大豆卵磷脂及胆固醇为膜材料，用逆向蒸发法对所得纳米杂化物进行脂质体包覆修饰，制备纳米复合体，记为(HCPT-Ch-LDH)@LS，考察其水分散稳定性和药物缓释行为。结果表明，HCPT-Ch-LDH纳米杂化物的载药量高达～15.8wt％，实现了HCPT的有效负载;(HCPT-Ch-LDH)@LS纳米复合体在水介质中具有良好的水分散稳定性，特别是冻干复合体样品在水中再分散后，其平均粒径可小于200nm，满足注射制剂的要求;脂质体包覆修饰还可改善纳米杂化物的药物缓释性能;(HCPT-Ch-LDH)@LS纳米复合体的药物释放过程符合准二级动力学模型，颗粒内部扩散为限速步骤。药物修饰-共组装法可达成非离子型疏水性药物在LDHs上的有效负载（插层），脂质体包覆修饰是改善纳米杂化物分散稳定性的有效途径。 (2)HCPT插层LHSs纳米杂化物的制备、修饰、表征及性能 采用“药物修饰”结合“共沉淀”法制备HCPT插层氢氧化锌硝酸盐(Zn5(OH)8(NO3)2·2H2O)LHSs纳米杂化物。在HCPT-Ch胶束存在下，将Zn(NO3)2溶液和NaOH溶液混合，通过共沉淀制备HCPT-Ch-LHS纳米杂化物，并对其化学组成、晶体结构和形貌等进行表征。采用脂质体包覆修饰纳米杂化物，制备(HCPT-Ch-LHS)@LS纳米复合物，考察其水分散稳定性和药物缓释行为。结果HCPT-Ch-LHS纳米杂化物载药量达～11.6wt％，表明药物修饰-共沉淀法也可实现非离子型疏水性药物在LDHs上的有效负载;脂质体包覆修饰可明显改善其水分散稳定性和药物缓释效果。(HCPT-Ch-LHS)@LS的药物释放明显变化部分的过程复合准一级动力学模型，颗粒内部扩散为其限速步骤。与LDHs基纳米复合体相比，所制备的LHSs基纳米复合体在载药量和水分散稳定性与之相近，但药物缓释效果更好。目前对LDHs研究很多，而对LHSs研究目前相对较少。本研究结果表明，与LDHs一样，LHSs也是有发展前景的药物载体。 (3)PEG偶联HCPT前体药合成、表征及聚集行为 通过聚乙二醇二羧基醚(PEG-biCOOH)的两个端羧基与HCPT的10位羟基(10-OH)间的酯化反应，将两个疏水HCPT分子通过酯键键合到亲水PEG链的两端，成功合成出双亲性PEG偶联HCPT前体药，记为PEG-bi(COO-HCPT)，并对其进行了表征。系统研究了其表面活性和聚集行为，特别探究了其聚集体结构，考察了其药物释放行为。结果表明，该前体药物的载药量高达～52.7wt％，且可显著增强HCPT水溶性，在水中的溶解度从～1.41μmol/L增大至～2.04mmol/L。PEG-bi(COO-HCPT)具有良好的表面活性，临界胶束浓度（CMC）约为0.38mmol/L。有趣的是，PEG-bi(COO-HCPT)在水介质中可自组装形成～130nm的囊泡结构，其临界囊泡浓度（CVC）约为23μmol/L。PEG-bi(COO-HCPT)具较好的药物缓释性能，其药物释放变化过程符合准二级动力学模型。本研究加深了对双亲性前体药物聚集行为的认识，也证明了PEG偶联是改善疏水性药物性能的有效途径之一。 (4)细胞毒性评价 采用MTT法，以人类非小细胞肺癌细胞(A549NSCLC)、人类肝癌细胞（HepG2）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC，正常细胞）为模型细胞，系统考察了所合成PEG-bi(COO-HCPT)及原料药HCPT的细胞毒性，亦考察了所合成三种载药体系HCPT-Ch-LDH、(HCPT-Ch-LDH)@LS和PEG-bi(COO-HCPT)对A549NSCLC细胞的毒性评价，同时考察了所用载体LDHs、Ch和PEG-biCOOH的细胞毒性。结果表明，所用载体均具较好的细胞相容性，为理想药物载体。所合成的三个载药体系HCPT-Ch-LDH、(HCPT-Ch-LDH)@LS和PEG-bi(COO-HCPT)均表现出明显的细胞毒性，孵育48h对A549NSCLC细胞系的IC50值分别约为1.48、1.32和0.324μg/mL，明显低于原料药HCPT的值(～27.5μg/mL)。三种载药体系的细胞毒性大小顺序为:PEG-bi(COO-HCPT)＞＞(HCPT-Ch-LDH)@LS＞HCPT-Ch-LDH。双亲性PEG-bi(COO-HCPT)前体药自组装形成的囊泡结构，似乎对细胞毒性具重要作用。另外，PEG-bi(COO-HCPT)对正常细胞(HUVEC)的毒性明显低于对癌细胞(NSCLC和HepG2)的毒性，这对其实际应用具重要意义。总之，脂质体包覆修饰药物-LDHs纳米杂化物和聚合物偶联双亲性前体药，是增强疏水性药物抗癌活性的有效途径。

目录

声明

摘要

1．1研究背景

1．2负载疏水性药物体系概况

1．2．1环糊精及其衍生物

1．2．2O/W型微乳液

1．2．3氧化石墨烯

1．2．4层状金属氢氧化物

1．2．5脂质体

1．2．6嵌段共聚物胶束

1．2．7纳米颗粒

1．2．8纳米悬浮液

1．2．9前体药物

1．2．10水凝胶

1．3层状金属氢氧化物(Layered Metal Hydroxides，LMHs)

1．3．1 LDHs的结构及插层基本原理

1．3．2 LDHs的制备及表征

1．3．3 LDHs常见性能

1．3．4 LDHs的剥离及重组

1．3．5 LHS的结构

1．3．6 LHS的合成与表征

1．3．7 LHS的潜在应用

1．4．1选择LDHs作药物载体的优势

1．4．2药物-LDHs纳米杂化物的制备

1．5脂质体

1．5．1脂质体的制备

1．5．2脂质体作为药物载体

1．5．3脂质体的表征

1．5．4脂质体类型

1．6前体药物

1．6．1前体药物的类型

1．6．2基于聚乙二醇的前体药物

1．7本论文选题目的、意义及主要内容

参考文献

第二章10-羟基喜树碱插层LDHs纳米杂化物制备、脂质体包覆修饰及性能

2．1实验部分

2．1．1原料和试剂

2．1．2 Mg3Al-NO3 LDH的制备及剥离

2．1．3 HCPT-Ch-LDH纳米杂化物的制备

2．1．4(HCPT-Ch-LDH)@LS纳米复合体的制备

2．1．5样品表征

2．1．6载药量的测定

2．1．7药物体外释放速率的测定

2．2结果与讨论

2．2．1 Ch-LDH和HCPT-Ch-LDH纳米杂化物的表征

2．2．2(HCPT-Ch-LDH)@LS纳米复合物的表征

2．2．3 体外释放

2．3本章小结

参考文献

第三章10-羟基喜树碱插层LHSs纳米杂化物制备、脂质体包覆修饰及性能

3．1实验部分

3．1．1原料和试剂

3．1．2 LHS及纳米杂化物的制备

3．1．3(HCPT-Ch-LHS)@LS纳米复合物的制备

3．1．5载药量的测定

3．1．6体外药物释放

3．2结果与讨论

3．2．1纳米杂化物的表征

3．2．2(HCPT-Ch-LHS)@LS纳米复合物的表征

3．2．3体外释放

3．3本章小结

参考文献

第四章聚乙二醇偶联10-羟基喜树碱前体药的合成、表征及其聚集行为

4．1实验部分

4．1．1原料和试剂

4．1．2前体药物PEG-bi(COO-HCPT)的制备

4．1．3样品测试

4．2结果与讨论

4．2．1前体药物PEG-bi(COO-HCPT)的表征

4．2．2 PEG-bi(COO-HCPT)在水中的自组装行为

4．2．3 PEG-bi(COO-HCPT)的体外药物释放

4．3本章小结

参考文献

第五章体外细胞毒性评价

5．1实验部分

5．1．1原料和试剂

5．1．2细胞及培养条件

5．1．3细胞毒性测试

5．2结果与讨论

5．3本章小结

参考文献

本论文主要结论、创新点及不足之处

致谢

攻读博士期间发表和待发表的论文