双重靶向性抗乳腺癌融合蛋白Δ1-9-G129R-T3原核表达质粒的构建及蛋白的诱导表达

摘要

目的：
　　利用基因重组技术,将具有特异性抑制乳腺癌细胞增殖作用的人催乳素受体(human prolactin receptor,hPRLR)拮抗剂Δ1-9-G129R-hPRL与具有特异性抗肿瘤血管生成活性的肿瘤抑素(tumstatin)的活性部位T3肽(69-88aa)进行桥连,构建新型双重靶向性抗乳腺癌融合蛋白Δ1-9-G129R-T3的原核表达质粒,并在原核表达宿主中进行目的蛋白的诱导表达和鉴定,为进一步进行融合蛋白的功能检测奠定基础。
　　方法：
　　首先以质粒pET22b(+)G129R-G129R为模板,PCR扩增两端带有限制性内切酶NdeI和XhoI以及NdeI和BamHI识别序列的目的基因Δ1-9-G129R-hPRL,并利用琼脂糖凝胶电泳进行片段回收。再根据T3的cDNA序列,设计合成三段首尾互补的引物,采用重叠延伸PCR技术,扩增得到带有限制性内切酶NdeI和XhoI以及BamHI和XhoI识别序列的目的DNA片段T3,并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行回收。然后,根据Δ1-9-G129R-hPRL的3’端与T3的5’端BamHI识别序列可互补的特点,将回收得到的Δ1-9-G129R-hPRL和T3混合作为模板,利用Δ1-9-G129R-hPRL的上游引物和T3的下游引物,PCR扩增得到带有限制性内切酶 NdeI和XhoI酶切位点的融合基因片段Δ1-9-G129R-T3。将纯化回收的Δ1-9-G129R-T3、Δ1-9-G129R-hPRL及T3片段通过T-A克隆分别与pMD18-T载体进行连接,转化大肠杆菌DH5α后,经蓝白斑筛选,挑取阳性克隆进行扩增,提取质粒,NdeI和XhoI双酶切鉴定后再次回收目的DNA片段。然后分别将双酶切回收的目的基因片段插入pET22b(+)的NdeI和XhoI多克隆位点,构建原核表达载体pET22b-Δ1-9-G129R-T3、pET22b-Δ1-9-G129R和pET22b-T3。经DNA序列测定正确后,将这三种重组表达质粒转化原核表达菌BL21(DE3),IPTG诱导表达后收集菌体,超声破碎,高速离心后分离沉淀和上清。最后通过SDS-PAGE和Western blot检测和鉴定融合蛋白表达。
　　结果：
　　琼脂糖凝胶电泳结果显示我们利用PCR扩增的方法获得了目的基因片段Δ1-9-G129R-T3(650 bp)、Δ1-9-G129R(586bp)和T3(72bp)。将NdeI和XhoI双酶切回收的目的基因分别插入经同样双酶切的pET22b(+),构建3种重组表达质粒pET22b-Δ1-9-G129R-T3、pET22b-Δ1-9-G129R和pET22b-T3。NdeI和XhoI双酶切鉴定显示酶切片段与插入的基因片段大小相符。DNA测序结果显示,除2个同义突变外的DNA序列与GenBank中记载的cDNA序列完全一致。将这些质粒转化 BL21(DE3)后,利用IPTG诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE结果证实,在超声处理后的沉淀中出现新蛋白条带,且与预期的分子量(约24.7 kD、22.2 kD、2.4 kD)大小相吻合。目的蛋白主要以不溶性包涵体形式存在,定位于细胞质。Western blot分析表明,诱导表达的菌体蛋白在约24kD和22kD处出现印迹,说明外源基因已经成功地在大肠杆菌中表达。
　　结论：
　　成功构建了融合蛋白Δ1-9-G129R-T3的原核表达质粒,并可以在原核表达宿主E.coli BL21(DE3)中进行高效表达,为下一步目的蛋白功能的检测做好准备。

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缩 略 词 表

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英文摘要

前言

1 催乳素与催乳素受体

2 催乳素与乳腺癌的关系

3 PRLR拮抗剂

3.1 第一代PRLR拮抗剂G129R-hPRL

3.2 第二代PRLR拮抗剂△1-9-G129R-hPRL

4 肿瘤抑素概述

5 研究内容

材 料 与 方 法

1实验材料

1.1主要实验试剂

1.2实验试剂盒

1.3工具酶

1.4 菌株与质粒

1.5 抗体

1.6 引物合成 由北京奥科生物技术有限公司完成。

1.7常用培养基和溶液配制方法

2 实验方法

2.1 目的基因的PCR扩增及产物的纯化回收

2.2 TA克隆

2.3 目的基因原核表达载体的构建

2.4 重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)

2.4目的蛋白的诱导表达和检测

2.5 目的蛋白的纯化

实 验 结 果

1 原核表达载体的构建

1.1 目的基因的扩增

1.2 目的基因的T-A克隆

1.3 目的基因原核表达载体的构建

1.4 重组质粒的DNA测序

2 目的蛋白的诱导表达和检测

2.1 SDS-PAGE检测目的蛋白的诱导表达

2.2 Western blot鉴定目的蛋白的表达

讨论

结论

参考文献

论文综述

致谢

待发表论文

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