喜马拉雅旱獭（Marmota Himalayana）微卫星位点的筛选与应用

摘要

以青藏铁路沿线喜马拉雅旱獭为材料，从肌肉组织中提取基因组DNA。由喜马拉雅旱獭近缘种文献及Genebank中筛选出多态性信息含量高的近缘1种微卫星序列，以其相应的18对引物对基因组DNA进行扩增。这18个近缘种微卫星序列为AF259372、AF259373、AF259374、AF259375、AF259376、AY197780、AY197781、AY197782、AY197783、AY197784、AY197785、AY702707、AY702708、AY702709、AY702710、AY702711、AY702712及SS-Bible。将扩增出来的序列回收，经pBS-T载体连接，转化入大肠杆菌DH5 α菌株，以(CA)。寡聚核苷酸引物和PUC19质粒多克隆位点两侧的M13primersM3和RV引物分别配对，PCR法筛选含微卫星序列的阳性克隆并进行测序。通过对几百个已鉴定为重组阳性克隆的筛选，获得21个含有微卫星的重组阳性克隆。将首次得到的21个喜马拉雅旱獭微卫星序列在GenBank注册，序列号为DQ888321～DQ888327，EF125660 ～EF125666，EF520117～EF125122。在21个微卫星序列中完美型14个，占67％；非完美型3个，占14％；复合型4个，占19％。利用BLAST序列分析软件对GenBank数据库进行检索，没有发现同源性一致的相应微卫星序列，表明本文得到的喜马拉雅旱獭微卫星序列都是首次发现的。此外，喜马拉雅旱獭微卫星的重复次数主要集中在20次以下，而20次以上的少见。 从这21个微卫星序列中选取重复区域长、侧翼序列好的座位使用Oligo6.0和Primer 5.0软件设计微卫星序列引物，共设计出5对不含茎环和二级结构的引物，长度在20bp左右。将5对引物进一步经过3％琼脂糖凝胶电泳检验筛选，其中4对引物具有多态性，4对引物为JA5F/JA5R，JA9F/JA9R，JD3F/JD3R，JD9F/JD9R。用这4对引物对沱沱河、海西洲、安多和乌兰四地的喜马拉雅早獭种群进行遗传多样性分析，海西洲喜马拉雅旱獭种群遗传多样性最高，其次为乌兰、沱沱河和安多地理种群。聚类分析发现，沱沱河与安多两地种群的遗传距离相对较小，但是总体而言四个种群之间遗传差异较小。本实验首次建立了喜马拉雅旱獭的微卫星分子标记，为进一步开展喜马拉雅旱獭及其近缘种群的分子生物学研究奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

1引言

1.1喜马拉雅旱獭遗传多样性的研究现状

1.2微卫星标记的研究进展

1.2.1微卫星的发现

1.2.2微卫星的特点

1.2.3微卫星突变的机制及影响因素

1.2.4微卫星位点遗传标记技术

1.2.5微卫星的应用

1.2.6微卫星标记的不足之处及发展前景

1.3本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1动物材料

2.1.2载体、菌株

2.1.3引物

2.2实验仪器和药品

2.2.1实验仪器

2.2.2主要药品和试剂

2.2.3实验主要试剂配制方法

2.3实验方法

2.3.1感受态细胞的制备

2.3.2质粒pUC19的提取(碱裂解法)

2.3.3喜马拉雅旱獭基因组总DNA的提取

2.3.4近缘种引物扩增喜马拉雅旱獭基因组DNA

2.3.5 PCR法筛选含微卫星序列的阳性克隆

2.3.6阳性克隆的序列测定

2.3.7测序结果分析

2.3.8微卫星引物的设计

2.3.9微卫星引物的初步筛选

2.3.10统计分析

3结果与分析

3.1喜马拉雅旱獭基因组DNA提取结果

3.2喜马拉雅旱獭近缘种引物扩增基因组DNA的结果

3.3连接与转化

3.4重组质粒的双酶切结果

3.5 PCR法筛选含微卫星的阳性克隆的结果

3.6阳性克隆的测序结果

3.7喜马拉雅旱獭与花白旱獭、旱獭微卫星序列的比较分析

3.8引物的设计与合成

3.9微卫星引物的初步筛选结果

3.10微卫星引物的进一步筛选

3.11微卫星座位等位基因的频率

3.12微卫星座位的多态信息含量

3.13种群间的聚类分析

4讨论

4.1近缘种微卫星的应用

4.2 PCR法筛选微卫星

4.3微卫星序列的测序

4.4微卫星引物的设计及应用

4.5 PCR扩增产物的检测

4.6不同地理种群的遗传多态性

5结论

参考文献:

附录

读研期间已发表的学术论文及会议摘要：

致谢