黑线仓鼠LRH-1的SNP及表达差异与胎仔数的关联性研究

摘要

近年来我国鼠害频发,对人类的生产和生活造成了极大的危害。黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)作为北方平原的主要农田害鼠,不仅分布范围广、繁殖力强,对农业的危害程度大,而且传播疾病。因此,研究鼠类种群暴发机理、鼠类种群动态特征以及高繁殖机制,对制定合理高效的农业害鼠综合治理措施就显得尤为重要。
　　肝受体同系物-1(liver receptor homolog-1,LRH-1)是一种在早期胚胎发育和成年个体中均有重要生理功能的转录因子,对胚胎和性腺发育过程、排卵过程都具有重要的调控作用。本研究以山东省沂南县和曲阜市黑线仓鼠为研究对象,根据GenBank数据库中大鼠(Rattus norvegicus)和小鼠(Mus musculus)的LRH-1基因设计引物,克隆出LRH-1基因启动子处475bp的DNA序列,1870bp(变体1)和1956bp(变体2)的mRNA序列,GenBank登录号分别为:JQ038149、JN367458和JN367459。黑线仓鼠LRH-1基因包含8个外显子和7个内含子,启动子上含有保守的GATA因子结合位点、E-box和典型的TATA盒。两种变体相差86bp的插入序列,分别编码541和501个氨基酸,其中亮氨酸(L)含量最高,达到10.9％与11.2％,色氨酸(W)含量最少,只有0.37％-0.4％,二级结构中含有大量的Alpha螺旋和Turn转角。变体2的蛋白缺失一个锌指结构,且受ER调控是乳腺癌细胞中LRH-1的重要形式。与其它19个物种的LRH-1 mRNA序列进行比对,发现核苷酸水平(65.2％-88.6％)和氨基酸水平(63.7％-90.6％)均有较高的相似性,系统进化和聚类分析表明,LRH-1基因作为与动物繁殖、胆酸合成途径相关的候选基因在不同物种之间同源性较高,在进化上相对保守。
　　对沂南和曲阜两个地理种群不同繁殖力黑线仓鼠LRH-1基因进行5调控区SNP分析,发现18个SNPs,包括13个转换和5个颠换位点,共定义了16种单倍型,GenBank登录号为:JN585737-JN585752。经DnaSP5.0软件计算发现遗传多样性水平具有沂南种群>曲阜种群的特点,曲阜种群只发现一种单倍型,说明LRH-1基因在曲阜地区更保守。两个地理种群的基因流(Nm)、遗传分化系数(Fst)和种群间的核苷酸歧异度(Dxy)显示沂南和曲阜两个地理种群黑线仓鼠LRH-1基因具有一定遗传分化,但不显著;种群间基因分化系数(Gst)显示有80.8％的遗传变异存在于种群内部。对不同胎仔数相关性分析得出:胎仔数集中于3-5的序列发生变异较小,随着胎仔数的增加单倍型多样性、核苷酸多样性和基于分离位点数目的多样性逐渐增加;胎仔数与突变总数和转换数之间具有极显著正相关关系(P<0.01);突变与TATA盒上游序列和exon1具有显著正相关关系(P<0.05),与TATA盒及exon1之间序列和颠换数无相关性,即随着胎仔数的增加,突变总数和转换数也增加,且突变多位于exon1和TATA盒上游。
　　对发情期黑线仓鼠LRH-1基因的表达量进行测定,发现其在心、肝、脾、胃、肺、肾、肾上腺、卵巢、子宫、睾丸、附睾、脑12种器官中均有表达,以肝脏的表达量为最高,性腺的表达量雌性高于雄性,卵巢的表达量高于肾和肾上腺,且比子宫高2个数量级。雌雄性器官比较得出卵巢的表达量最高,其次为雄肾上腺、雌肾上腺、雄肾、雌肾、子宫、睾丸和附睾;随着胎仔数的增加卵巢内LRH-1的表达量逐渐减少,而子宫内的表达量先减少后增大;不同地理种群雄性黑线仓鼠中肾上腺的差异最明显,且表达量沂南>曲阜。这一结果揭示LRH-1与排卵可能存在密切关系,这也与LRH-1调节卵巢发育、胚胎发育、卵巢性激素的合成等功能相吻合,此研究有助于揭示LRH-1与人类生殖及疾病的关系,为疾病的早期诊断和有效治疗提供新靶点。
　　本实验中对黑线仓鼠LRH-1基因多态性的研究,对了解其多态性及表达量与胎仔数之间的关系具有重要意义,同时也为进一步研究黑线仓鼠LRH-1基因在各种复杂生理活动的调控中所发挥的生理功能奠定基础,从而从分子遗传学角度为鼠害的防治提供科学依据。

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1 文献综述

1.1 LRH-1 研究背景

1.2 黑线仓鼠研究进展

1.3 SNP 研究进展

1.4 繁殖状态的鉴定

1.5 实时荧光定量PCR 技术及其应用

1.6 研究目的及意义

2 实验试剂和设备

2.1 实验药品和试剂

2.2 实验仪器和设备

3 黑线仓鼠LRH-1 基因引物设计

4 实验一 LRH-1 基因全序列的克隆及蛋白质的同源建模

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

5 实验二 黑线仓鼠LRH-1 的SNP 分析

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

5.4 讨论

6 实验三 不同胎仔数黑线仓鼠LRH-1 的差异表达

6.1 实验材料

6.2 实验方法

6.3 结果与分析

6.4 讨论

7 结论

参考文献

硕士期间发表文章

致谢