拮抗解淀粉芽孢杆菌的筛选鉴定及其产胞外抗菌物质的初步研究

摘要

植物病害给全球经济造成巨大损失,目前解决该问题的办法主要是使用化学杀菌剂,培育抗病新品种等,但化学杀菌剂污染环境,给人畜的健康造成威胁；抗病新品种在培育过程中,经济成本高,培育周期长;由于该些问题的存在,植物病害现象未能得到有效的控制。植物病害多是由病原真菌所引起,利用拮抗菌的生防机制来控制植物病害既高效又环保,具有广阔的空间。
　　本文旨在以12株病原菌为指示菌,自本实验室保存的300余株芽孢杆菌中进行广谱拮抗芽孢杆菌的筛选,测定其所产抗菌物质的抑菌谱。结合形态学观察、生理生化鉴定以及16S rDNA同源性分析,对筛选获得的拮抗芽孢杆菌进行鉴定,测定其理化性质稳定性,优化该拮抗芽孢杆菌产抗菌物质的发酵条件,并对其所产抗菌物质进行初步分离纯化。本实验的主要实验方法和实验结果如下:
　　1、以9株病原真菌与3株病原细菌为病原指示菌,采用平板打孔法与牛津杯法,自实验室保存的300余株芽孢杆菌中进行拮抗菌株的筛选,并对其所产抗菌物质的抑菌谱进行测定。最终获得一株广谱拮抗芽孢杆菌NCPSJ7。
　　2、结合形态观察与革兰氏染色观察,生理生化鉴定,16SrDNA鉴定等手段,对拮抗芽孢杆菌NCPSJ7进行鉴定。结果显示,NCPSJ7的个体形态,菌落特征,生理生化特征均与解淀粉芽孢杆菌相似。通过提取NCPSJ7的基因组DNA,PCR扩增,将16S rDNA序列在NCBI网站中进行同源性分析比较,其与编号NC016784.1等前几株解淀粉芽孢杆菌的同源性高达99％。因此将NCPSJ7鉴定为解淀粉芽孢杆菌。
　　3、为了更好地了解拮抗解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7所产抗菌物质的理化性质,本实验以西瓜枯萎病菌与桃根霉腐烂病菌为病原指示菌,以抑菌圈直径的大小为抑菌性能的衡量指标,对NCPSJ7抗菌物质粗提液的热稳定性、蛋白酶稳定性、pH稳定性以及有机溶剂的稳定性分别进行检测。结果显示,NCPSJ7在4℃、40℃、60℃、80℃、100℃、121℃下处理30min,其抑菌性能稳定。经胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K于37℃处理90min,其抑菌性能几乎不变。经pH8、9、10处理3h后,其抑菌性能趋于稳定。经乙腈于37℃处理4h后,其抑菌性能在稳定的基础上甚至有所提高。综上所述,NCPSJ7所产抗菌物质具有稳定的理化性质。
　　4、为了提高抗菌物质产量,本实验对拮抗解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7产抗菌物质的发酵条件进行优化。以西瓜枯萎病菌与桃根霉腐烂病菌为病原指示菌,以抑菌圈直径的大小为抑菌性能的衡量指标。优化后的发酵条件为:发酵时间:6天,装液量:100mL/250mL,接种量:3.00%,转速:150r/min,发酵温度为34℃。
　　5、本实验通过葡聚糖Sephadex G-100凝胶对经硫酸铵沉淀的NCPSJ7进行初步分离纯化,并以西瓜枯萎病菌与桃根霉腐烂病菌为病原指示菌,以抑菌圈直径的大小为抑菌性能的衡量指标,对初步分离纯化所得峰进行抑菌性能检测。利用SDS-PAGE对初步分离纯化所得峰进行蛋白质相对分子质量测定。结果显示,经葡聚糖Sephadex G-100凝胶初步分离纯化所得的峰Ⅱ具有抑菌性能,且经SDS-PAGE检测显现出一条谱带,其相对分子质量约为24kDa。
　　本文筛选获得一株广谱拮抗解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7,其理化性质稳定,对其产抗菌物质的发酵条件进行优化,并对其所产抗菌物质进行初步分离纯化。该实验为生物防治提供科学依据,为工业生产奠定良好基础。

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第一章 文献综述

引言

1.1 植物病害的防治方法

1.2 拮抗芽孢杆菌的概述

1.3 拮抗芽孢杆菌的应用现状

1.4 解淀粉芽孢杆菌

1.5 生物防治存在的问题与展望

1.6立题依据、技术路线与研究内容

第二章 拮抗芽孢杆菌的筛选

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第三章 拮抗芽孢杆菌的鉴定

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第四章 拮抗解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7抗菌物质粗提液理化性质研究

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

第五章 拮抗解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7产抗菌物质发酵条件的优化

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 结果与讨论

5.4 本章小结

第六章 拮抗解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7抗菌物质的初步分离纯化

6.1 实验材料

6.2 实验方法

6.3 结果与讨论

6.4 本章小结

第七章 结果与展望

7.1 结论

7.2 展望

参考文献

在校期间的研究成果及发表的学术论文

致谢