基于酶循环放大的表面等离子体共振传感器的研究

摘要

本文介绍了一种修饰有捕获探针金表面的表面等离子共振(SPR)用于检测ATP浓度的技术、一种具有双官能团修饰的纳米光学信号发生器和一种利用剪切酶循环放大检测MicroRNA的方法。
　　SPR检测器是一种高灵敏度和线性范围的检测器，物质在共振表面吸附则可产生可用光学信号。利用其这一特点可以制造出高灵敏度的检测器。而DNA的杂交具有特异性，两者的结合使用可以获得高灵敏度和高选择性兼顾的检测器。但是由于传统的DNA杂交方式产生的质量和折射率变化比较小，所以在实验中使用了两种互补的发卡型放大探针来将其质量扩增数十倍用于检测，更加降低了该检测方法的检测限，使其适用于更低浓度的样品。
　　链式杂交反应(HCR)不同于传统的酶催化循环放大反应，放大过程中是靠两个发卡状的DNA来进行的。当引发DNA存在的时候，其中之一种发卡会打开，并且引发另外一种发卡打开并且与之互补。而另外一种发卡上的部分序列又与引发DNA相同，随之引发第一种发卡的打开，循环进行聚合反应。当聚合物依靠引发DNA固定在SPR这种基于折射率的质量检测器表面时，便可以进行引发DNA的放大检测。如果将引发DNA设计为ATP适体的互补序列，则ATP就可以从适体上将其取代下来，这时使用和引发DNA部分互补的捕获探针修饰在传感器表面，捕获引发DNA后继而在表面进行HCR，则可用来进行ATP的检测。这个检测方式的优点很明显，没有酶的参与，减少了反应的步骤，消除了酶促反应所需缓冲带来的干扰。
　　另外表面等离子共振现象可以用于荧光信号的增强。所以本实验中制备了一种利用金表面进行SPR荧光增强的一种纳米光学信号产生器。其原理为在纳米金颗粒(AuNP)表面包裹大孔二氧化硅并且使用羧基修饰二氧化硅表面。这样使得裸露的金面可以修饰巯基修饰的DNA捕获探针，而二氧化硅表面可以修饰带有氨基修饰的双链DNA检测探针。双链检测探针中，其中一条为氨基修饰的固定链，另一端修饰有猝灭剂，序列为ATP适体。另一条单链修饰有荧光基团。当没有ATP存在的时候，由于猝灭剂的作用，荧光信号将不会产生。而ATP存在时，会竞争ATP适体而释放荧光信号探针与金表面的捕获探针互补杂交。这时候由于荧光物质靠金表面非常近，可以产生表面等离子共振荧光增强，放大原有的荧光信号。整个纳米粒子构成一个微型的荧光逻辑门传感器。相比传统的检测器，不但实现了同一粒子的双功能修饰，还增强了不易受到干扰的光学信号，而纳米颗粒的应用，使得其可以被细胞吞噬而应用在活体在线检测上。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 DNA传感器

1．1．1 DNA传感器的工作原理

1．1．2 DNA传感器的修饰类型

1．1．3 光学DNA传感器

1．1．4 电化学DNA传感器的类型

1．2 表面等离子共振(SPR)传感器

1．2．1 金纳米粒子信号增强生物传感

1．2．2 金纳米粒子增强SPR信号对小分子的传感

1．2．3 金纳米粒子增强SPR信号成像生物传感器

1．2．4 磁性纳米粒子增强SPR传感

1．2．5 展望

1．3 表面增强拉曼光谱(SERS)

1．3．1 环境监测

1．3．2 生物传感

1．4 荧光光谱检测

1．4．1 引言

1．4．2 不同的荧光传感器

1．5 本文的思路及目的

参考文献

第二章 杂交链式反应用于表面等离子共振检测DNA和小分子物质的信号放大

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 器材

2．2．2 所需试剂

2．3 实验的准备工作

2．3．1 配制0．1M，pH=6．8的咪唑盐酸缓冲体系

2．3．2 配制0．02M磷酸盐缓冲体系(PBS)

2．3．3 DNA的预处理

2．3．4 磁珠的活化工作

2．3．5 ATP信号发生器的制备

2．3．6 H1、H2放大探针的准备工作

2．3．7 ATP样品及NTP阴性对照品制备

2．4 实验部分

2．4．1 所有杂交可能性的检查

2．4．2 HCR用于SPR信号放大检测DNA

2．4．3 HCR用于SPR信号放大检测ATP

2．5 实验结果以及讨论

2．5．1 实验原理

2．5．2 实验可行性的结果与讨论

2．5．3 SPR检测DNA的结果与讨论

2．5．4 对靶DNA选择性测试

2．5．5 SPR检测ATP的结果和讨论

2．5．6 镀金膜芯片再生测试

2．6 小结

参考文献

第三章 基于表面等离子体共振拉曼信号增强作用剪切酶循环放大荧光放大传感器的研究

3．1 引言

3．2 实验耗材

3．2．1 实验所需仪器

3．2．2 实验所需试剂

3．2．2 DNA序列

3．3 实验的准备工作

3．3．1 配制0．02M磷酸盐缓冲体系(PBS)

3．3．2 DNA的预处理

3．3．3 1％氯金酸溶液的制备

3．3．4 金胶的制备

3．3．5 无水DMF(N，N-二甲基甲酰胺)的制备

3．3．6 3-(丁二酸单酰胺基)丙基三乙氧基硅烷的制备

3．4 实验部分

3．4．1 介孔二氧化硅壳包覆金纳米颗粒的制备

3．4．2 介孔二氧化硅壳金溶胶的外表面羧基化修饰

3．4．3 双修金球ATP纳米传感器的制备

3．4．4 检测ATP

3．4．5 酶循环放大检测ATP

3．5 实验结果讨论

3．5．1 实验原理

3．5．1 金纳米粒子的表征和选择

3．5．2 介孔二氧化硅包覆金纳米颗粒的表征及其修饰后的表征

3．5．3 罗丹明B荧光测试参数的确定

3．5．4 介孔二氧化硅壳纳米金颗粒溶胶对荧光的增强效果测试

3．5．5 荧光素(FAM)的荧光测试参数确定

3．5．6 FAM信号测试

3．5．7 酶用量的确定

3．5．8 ATP检测

3．5．9 选择性测试

参考文献

结论

致谢

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