粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在巴斯德毕赤酵母中的表达研究

摘要

目的：通过具有创新性的基因工程手段获得粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因，并将其按照酵母偏爱密码子优化，消除自然序列中存在的发夹结构，然后导入巴斯德毕赤酵母表达系统，使其诱导表达，获得具有生物活性且具有一定经济价值的GM-CSF。 方法：首先从人体基因组克隆得到hGM-CSF全基因，然后通过采用引物5'端加长法克隆了含127个编码氨基酸的hGM-CSF，在引物克隆过程中对该基因做了局部的密码子优化。最后通过高保真Taq酶扩增和EcoRI单酶切的方法将该基因整合进毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K，通过电击转化和甲醇诱导筛选，最终获得一株摇瓶水平粗蛋白表达量达3.89g/l的转化子。 结果：PCR、SDS-PAGE与westeran blotting免疫杂交证实hGM-CSF活性正常。SDS-PAGE电泳发现所表达的hGM-CSF均发生了糖基化，通过N-糖苷酶F去糖基化也证实了这点。 结论：本研究成功构建了可高效表达、有效分泌hGM-CSF的重组毕赤酵母工程菌，提供了一条产量高、分离纯化简便，可低成本大规模生产hGM-CSF的新途径。为实现hGM-CSF生产的产业化奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一章材料与方法

1.1材料

1.2方法

第二章结果

2.1 hGM-CSF编码基因的获得

2.2构建酵母分泌型表达载体

2.3重组分泌表达载体转化毕赤酵母及重组酵母的筛选

2.4多拷贝重组酵母的筛选

2.5酵母重组子的PCR检测

2.6可分泌表达GM-CSF重组酵母的初筛

2.7重组酵母分泌表达产物的Western blotting分析

2.8重组酵母分泌表达产物的去糖基化分析

2.9重组酵母分泌表达产物的活性检测

第三章讨论

第四章结论

第五章参考文献

第六章综述

攻读学位期间的研究成果

致谢