扇贝多肽经由ROS/Fas/caspase-8通路抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡

摘要

目的: 建立UVB诱导的HaCaT细胞凋亡模型，从活性氧(ROS)、凋亡相关分子Fas(CD95)、Fas相关死亡结构域(FADD)及半胱天冬酶-8(caspase-8)的角度，研究扇贝多肽(Polypeptide from Chlamys farreri，PCF)抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡的分子机制。 方法: 采用正交实验设计，以流式细胞仪PI染色法测定细胞凋亡率，确立UVB诱导的HaCaT细胞凋亡模型。实验设计为6组：对照组、UVB模型组、UvB+5.68mmol·L-1维生素C阳性对照组、UVB+5.69mmol·L-1 PCF组、UVB+2.84mmol·L-1PCF组、UVB+1.42mmol·L-1 PCF组。以2,7.二氯氢化荧光素二酯(DCFH-DA)为荧光探针，检测PCE对UVB照射后细胞内ROS生成的影响；应用小干扰RNA(siRNA)干扰UVB辐射的HaCaT细胞的Fas表达；荧光染色(Hoechst33258)分析PCF对UVB诱导的HaCaT细胞凋亡的影响；琼脂糖凝胶电泳分析FassiRNA、ROS清除剂(N-acetyl-L-cysteine，NAC)及caspase-8抑制剂(z-IETD-fmk)对细胞凋亡的影响；RT-PCR检测Fas(CD95)mRNA的表达；蛋白质印迹法检测细胞色素C(Cyto C)、FADD及caspase-8、caspase-3和多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的表达。 结果: 正交实验结果表明，20mJ·cm-2UVB照射HaCaT细胞后18h为最佳凋亡模型；PCF能明显抑制UVB引起的HaCaT细胞凋亡及细胞内活性氧的产生；干扰Fas及预先加入NAC和z-IETD-fmk可显著抑制UVB诱导的HaCaT细胞DNALadder的形成；1.42～5.69mmol·L-1剂量范围内的PCF可剂量依赖性抑制UVB引起的Fas、FADD的表达、线粒体细胞色素C的释放及caspase-8、caspase-3和PARP的活化。 结论: PCF可抑制20mJ·cm-2UVB诱导的HaCaT细胞凋亡，其作用机制与阻断ROS-CytoC通路和Fas-FADD-caspase-8-CytoC-caspase-3-PARP通路有关。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一章实验材料

1.1细胞株

1.2主要试剂和材料

1.3仪器设备

第二章实验方法

2.1实验设计及模型建立

2.2实验项目和指标检测

2.3统计学处理

第三章实验结果

3.1 UVB诱导HaCaT细胞凋亡模型的筛选

3.2 PCF抑制ROS的产生而抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡

3.3 PCF抑制细胞色素C释放而抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡

3.4 PCF抑制Fas激活而抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡

3.5 PCF抑制FADD激活而抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡

3.6 PCF抑制caspase-8活化而抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡

3.7 PCF抑制caspase-3和PARP的裂解而抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡

3.8附图

第四章讨论

结论

参考文献

综述 紫外线B诱导的凋亡信号通路研究进展

附录 中英文缩略词表

攻读学位期间的研究成果

致谢