内皮抑素真核表达系统的构建与其抗血管生成及抑瘤效应的实验研究

摘要

目的：构建重组人内皮抑素(recombinant human Endostatin，thES)的毕赤酵母真核表达系统；观察thES（恩度Endostar）的对角膜新生血管及裸鼠乳腺癌MCF-7的抑制作用，为进一步临床研究做准备。 方法：采用RT-PCR技术从人肝中扩增人ES基因。经DNA序列分析后将扩增的基因克隆至酵母载体pPIC9,通过电转化将线化的重组质粒转化到毕赤酵母GS115细胞，摇床培养并筛选出内皮抑素高表达菌株。然后应用thES(Endostar)进行动物有效性实验。动物实验（一）选取新西兰大白兔20只，采用碱烧伤法制备兔角膜新生血管( corneal neovascularization，CNV)模型，随机分为2组，每组10只。实验组球结膜下注射thES(Endostar)0.05ml，隔日1次；对照组球结膜下注射生理盐水0.05ml，隔日1次，定期摄相，比较CNV生长面积。利用免疫组化CD34染色的方法，在显微镜下进行微血管计数。动物实验（二）建立人乳腺癌裸鼠模型30只，随机分成2组，每组15只。接种乳腺癌细胞悬液后第1周于种植部位皮下注射thES(Endostar)，隔天1次，剂量为10.0 mg/kg（治疗组），对照组以PBS溶液代替，共用7周。第8周颈椎脱位处死裸鼠，完整剥离肿瘤，检测肿瘤体积、抑瘤率、肿瘤微血管密度(microvessel density，MVD)、癌细胞凋亡指数(apoptotic index，AI)。 结果：成功克隆人ES基因，并成功地构建了thES毕赤氏酵母真核表达系统；筛选出两株重组酵母，经SDS-PAGE分析，均能表达分子量为20kDa的内皮抑素蛋白。动物实验（一）示实验组、对照组的4、7、14、19天的CNV面积分别为(4.06±0.52；5.67±0.61;17.71±1.65:12.09±1.32)mm2、(4.80±0.63;8.48±1.03;23.91±1.82；16.75±1.79)mm2；MVD分别为3.60±0.94、5.87±1.44；动物实验（二）示实验组、对照组的肿瘤体积分别为(18374.6±471.2.)mm3、(43604.7±495.1)mm3，抑瘤率为57.86％; MVD分别为(14.08±3.48)、(25.25±4.73)；AI(％)分别为11.54±2.85、4.25±2.18；上各项数据间差异有显著性(p<0.01) 结论：thES毕赤酵母真核表达系统的成功构建，使高效表达ES蛋白成为可能，为生物制药企业批量生产奠定了理论基础；thES(恩度Endostar)能有效抑制兔角膜血管生成及裸鼠乳腺癌的生长，有广阔的临床应用前景。

目录

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英文文摘

声明

引言

第一章材料与方法

1.1材料

1.1.1人肝脏组织的获得

1.1.2菌株、质粒

1.1.3分子生物学工具酶

1.1.4主要生化试剂

1.1.5常用试剂和缓冲液

1.1.6细胞培养用品

1.1.7主要仪器

1.1.8内皮抑素纯化蛋白

1.1.9细胞株

1.1.10实验动物

1.2方法

1.2.1引物设计

1.2.2 人ES基因的RT-PCR扩增

1.2.3 pKS／ES重组质粒的构建与鉴定

1.2.4酵母转化重组质粒pPIC9／ES构建与鉴定

1.2.5酵母GS115宿主菌的转化

1.2.6酵母菌转化子的筛选

1.2.7 PCR法鉴定酵母转化子

1.2.8 ES在酵母中的表达检测

1.2.9 rhES(恩度Endostar)抗血管生成和抑瘤效应的测定

1.2.10统计学处理

第二章结果

2.1 人ES基因的获得

2.2 ES真核表达载体的酶切鉴定

2.3毕赤酵母GS115转化子的鉴定

2.4 rhES在酵母中的表达检测

2.5 rhES(恩度Endostar)抗血管生成和抑瘤效应的测定

第三章讨论

第四章结论

附图

参考文献

综述 内皮抑素及其抗肿瘤作用的研究与进展

攻读学位期间的研究成果

附录

致谢