VEGFR-1为靶的siRNA抑制乳腺癌细胞增殖的体内外研究

摘要

背景与目的：人类和动物血管生成与肿瘤生长、侵袭、转移密切相关，肿瘤的血管形成(Angiogenesis)是一个相当复杂的过程，受多种因子的正负调控，血管内皮生长因子(VascularEndothelial Growth Factor，VEGF)（正性调控因子）能特异性与血管内皮生长因子受体(Vascular Endothelial Growth Factor Recepter，VEGFR)结合[1-4]，促进内度细胞的分裂、增殖及迁移，在肿瘤新生血管生成过程中起着至关重要的作用，抗血管生成疗法已有效应用于肿瘤治疗。已发现的VEGFR有三种：VEGFRl(FLT-1)、VEGFR2（FLK-1、KDR）和FLT-4，VEGFR1在VEGF相关的病理性血管形成中发挥了重要作用[5]，其在乳腺癌细胞中阳性表达率达80％。理论上如果抑制VEGFR1的表达，即应阻止肿瘤血管的生成从而抑制肿瘤生长/细胞增殖，成为肿瘤治疗的一个途径。因此，本课题采用化学修饰的siRNA在体内外敲减VEGFR1基因，探讨化学修饰的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)介导的RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术在乳腺癌基因治疗的可行性及特异性。 方法：设计针对人和鼠VEGFR1基因的siRNA，选用阳离子脂质体Lipofectamine2000TM为转染试剂，将siRNA转染乳腺癌细胞株MCF-7、SH2-88和SK-BR-3裸鼠移植瘤，体内外诱导RNAi。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖，逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)和蛋白印迹试验(western blotting)分别检测体内外siRNA治疗组与对照组VEGFR1基因表达变化。 结果：体外实验结果显示：靶向VEGFRl基因siRNA转染乳腺癌细胞后，两种细胞增长均明显减慢，细胞增殖均被抑制，人和鼠乳腺癌细胞生长抑制率达50.1％、49.8％； VEGFRlmRNA和蛋白的表达均明显降低(p<0.05)，VEGFRl siRNA50 nmol/L、100 nmol/L和200 nmol/L，3组数据均有统计学意义(P<0.05)，50 nmol/L与100 nmol/L和200 nmol/L组相比有统计学意义(P<0.05)，而100 nmol/L和200 nmol/L两组之间比较无统计学意义(P>0.05)。VEGFRl siRNA抑制细胞增殖，并且在一定范围内抑制率随着浓度增加而增加，达到一定浓度后，再增加siRNA浓度并不提高沉默作用。裸鼠体内实验结果显示：siRNA治疗组裸鼠生长状态良好，体重稳定，瘤组织的增长受到明显抑制；RT-PCR、蛋白印迹试验的VEGFR1变化与体外试验结果一致。体内外对照组各指标均无显著变化。 结论：化学修饰的siRNA介导的RNAi在体内外均能成功下调靶基因VEGFR1的表达，抑制乳腺癌细胞增殖，是潜在的肿瘤治疗新方法，而VEGFR1亦可作为肿瘤治疗的新靶点。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一章实验材料

1.1细胞株及培养体系

1.2实验动物

1.3药品与试剂

1.4材料与仪器

第二章实验方法

2.1细胞体外实验

2.1.1转染条件优化实验

2.1.2 MTT法检测细胞增殖

2.1.3 RNA提取与RT-PCR

2.1.4 Western Blotting

2.2裸鼠体内抑瘤试验

2.2.1动物模型的建立

2.2.2裸鼠的观察与处理

2.2.3半定量RT-PCR及western Blotting检测移植瘤组织中VEGFR1mRNA表达水平

2.3统计学处理

第三章实验结果

3.1体外实验结果

3.1.1 VEGFR1 siRNA的设计

3.1.2 VEGFR1 siRNA转染后乳腺癌细胞MTT代谢率的变化

3.1.3半定量RT-PCR显示VEGFR1 mRNA表达的变化

3.1.4 VEGFsiRNA对乳腺癌细胞靶蛋白表达的影响

3.2裸鼠体内试验结果

3.2.1移植瘤体积生长情况

3.2.2体内RT-PCR试验结果

3.2.3 Western blotting检测VEGFR-1 siRNA对靶蛋白表达的影响

第四章讨论

4.1 RNA干扰技术生物学特性及siRNA的设计合成

4.2 RNAi在细胞水平的研究

4.3 RNAi在动物体内的研究

结论

参考文献

综述及参考文献：RNA干扰的研究进展

攻读学位期间的研究成果

致谢