还原叶酸载体(RFC)、二氢叶酸还原酶(DHFR)及谷胱甘肽巯基转移酶(GST-π)与骨肉瘤MTX化疗耐药机制的研究

摘要

目的：研究RFC（还原叶酸载体）、GST-π（谷胱甘肽S转移酶π）、DHFR（二氢叶酸还原酶）mRNA在入骨肉瘤U2-OS细胞系及人骨肉瘤耐药细胞系U2-OS/R1-R2中的表达差异，并探讨其在人骨肉瘤MTX化疗耐药中的意义。 方法：采用冲击并逐步增加诱导药物浓度诱导的方法，诱导人骨肉瘤细胞系U2-OS，并建立耐MTX细胞系(U2-OS/R1-R3)； MTT法检测各细胞株对氨甲喋呤(MTX)，顺铂(DDP)，阿霉素(ADM)及异环磷酰胺(IFO)的药物敏感性，计算半数抑制浓度(IC50)和耐药指数(RI)；利用倒置显微镜观察细胞一般形态改变，绘制生长曲线，检测细胞生长能力；利用流式细胞仪检测各细胞株细胞周期分布；利用荧光定量PCR技术在mRNA水平检测RFC、GST-π、DHFR在U2-OS及(U2-OS/R1-R3)中的表达。 结果：本试验成功建立三株入骨肉瘤耐药细胞系U2-OS/R1-R3，细胞生长曲线示耐药细胞株较原代细胞生长时间延长；流式细胞仪测细胞周期结果示耐药细胞株阻滞在G1期，MTT法示耐药细-胞株U2-OS/R1-R3对MTX耐药指数分别为原代的49.19、60.13、63.3倍；荧光定量PCR结果显示人骨肉瘤耐药细胞系U2-OS/R1-R3中RFC mRNA的表达为原代U2-OS的0.7139、0.6258、0.4908倍(组间差别有统计学意义，P<0.05)，RFC. mRNA的表达随肿瘤耐药性的增加而降低；U2-OS/R1-R3 DHFR mRNA的表达为原代U2-OS的5.3145、12.8937、30.6501倍(组间差别有统计学意义，P<0.05)，DHFR mRNA随肿瘤耐药性的增加而增加；U2-OS/R.-R。中GST-πmRNA的表达为原代U2-OS的1.9081、3.5420、4.8319倍（组间差别有统计学意义，P<0.05)，GST-πmRNA的表达随肿瘤耐药性的增加而增加. 结论：MTX耐药与DHFRmRNA表达增加有关，与RFCmRNA的表达降低有关，与GST-πmRNA的表达增加有关。本试验在基因水平探讨入骨肉瘤细胞MTX化疗耐药机制， DHFR、GST-π基因表达的增加及RFC基因表达的降低参与了人骨肉瘤细胞的MTX耐药，为临床探索骨肉瘤患者的MTX耐药机制提供了重要的依据，为临床筛选MTX化疗不敏感患者提供重要的依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一章材料与方法

1.1实验材料

1.1.1细胞系及其培养所需的主要试剂

1.1.2实验中的主要化学药品与试剂

1.1.3实验中的主要仪器

1.2实验方法

1.2.1化疗药物的配置

1.2.2细胞培养

1.2.3细胞的冻存与复苏

1.2.4耐药细胞系的诱导

1.2.5倒置显微镜下细胞形态

1.2.6细胞生长曲线的测定

1.2.7细胞周期分布的测定

1.2.8药敏实验

1.2.9实时荧光定量-PCR法检测U-20S、U2-0S/R1、U2-0S/R2、U2-0S/R3细胞株中RFC、DHFR、GST-π基因mRNA的表达

1.3统计学处理

第二章结果

2.1人骨肉瘤耐MTX细胞系U2-OS／(R1-R3)的建立

2.2细胞形态的观察

2.3人骨肉瘤耐MTX细胞株U2-OS／(R1-R3)多药耐药表型分析

2.4生长曲线

2.5细胞周期分析

2.6目的基因RFC、DHFR、GST-π的mRNA的表达

第三章讨论

3.1骨肉瘤的化疗

3.2 MTX的药理作用

3.3 MTX耐药机制

3.4还原叶酸载体(RFC)

3.5二氢叶酸还原酶(DHFR)

3.6谷胱苷肽巯基转移酶(GST)

3.7实时荧光定量PCR

结论

附图

参考文献

综述 骨肉瘤治疗研究进展

攻读学位期间的研究成果

致谢