抗菌肽HEDISTIN和二氢叶酸还原酶突变体DHFR-W21H的结构及生物作用机制研究

摘要

在后基因组时代,基因的表达产物及基因功能的实施者—蛋白质的结构与功能成为一个新的研究热点。核磁共振(NMR)是一种很好的研究多肽和蛋白质空间结构,进而研究其结构与功能关系的研究工具。在本论文中,我们主要利用液体核磁共振技术对抗菌肽HEDISTIN和二氢叶酸还原酶突变体DHFR-W21H的溶液结构及其生物功能的作用机制进行了详细的研究。论文分为以下两个部分:
　　 一、抗菌肽HEDISTIN在溶液中的构象及其抗菌机理研究
　　 随着抗生素的广泛使用,耐药菌株和多重耐药菌株不断增加,病原菌的抗药性问题日益严重,迫使人们加紧寻找传统抗生素的替代品。抗菌肽是在生物体中广泛存在的一类具有生物活性的小分子多肽,这类活性多肽具有抗菌活性高、种类比较多、抗菌谱广、特别是靶菌株不易产生耐药性的特点,具备了开发成新型抗菌药物的巨大潜力。2007年从沙蚕体腔内分离得到一种新型抗菌肽HEDISTIN,它是首个从海生环节动物中发现的被溴化的抗菌肽。它对革兰氏阳性菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicilin-resistant S.aureus)等表现出很好的抗菌性。但是,在抗菌作用机制尚不清楚的条件下,很难进一步开发。为了探究抗菌肽HEDISTIN的抗菌机理,我们首先应用NMR与圆二色谱(CD)技术解析了HEDISTIN在磷酸盐缓冲液和在DPC(dodecylphosphocholine)微团环境中的三维结构。结果表明,抗菌肽HEDISTIN在磷酸盐环境中没有稳定的有序构象,但在DPC微团环境下形成了独特的helix-turn-helix构象。这种helix-turn-helix构象与大多数阳离子小型多肽所具有的简单的线型螺旋构象不同,由于中间的转角而呈现出非均一性,但仍具有显著的两亲性特征。以此结构为基础,我们进一步采用分子动力学方法模拟了HEDISTIN作用于细胞膜的模拟膜—POPC脂双层膜的相互作用过程。模拟数据显示,该抗菌肽结构上的非均一性直接影响肽与膜作用的早期行为:第一段螺旋区(残基Leu5-Lys8)或第二段螺旋区(残基Val13-Ala17),通过极性作用力,最先与膜的磷脂头部区域接触,并渗透入膜的疏水性区域,中间的转角(残基Val9-Thr12),作为极性微弱的区域,则是作为最后一部分接触并进入膜中。这一现象提示,微团环境中的两亲性非均一构象相当接近当该肽遭遇菌细胞膜时的天然构象,以这种构象作用于细胞膜,提高了攻击效率。更为重要的模拟数据显示,随着抗菌肽浓度在膜表面某些局部区域的升高,肽的分子之间发生聚集,当肽和脂的比例达到或超过5/128时,聚集在一起的肽协同对膜造成较为强烈的扰动,以至于在膜中形成水分子通道。可以推测,这种水通道的形成会使细胞由于水的进入而最终胀裂破碎,抗菌肽HEDISTIN以此达到杀菌的目的。
　　 二、二氢叶酸还原酶突变体DHFR-W2lH的结构和作用机制研究
　　 二氢叶酸还原酶(DHFR)是生物体内广泛存在的叶酸代谢关键酶,它在辅酶NADPH的作用下将二氢叶酸还原为四氢叶酸,对生物体内细胞的代谢起到重要作用。在已报道的DHFR序列中,Trp21是极其保守的氨基酸残基之一,它在空间位置上既靠近辅酶NADPH又靠近底物。对这一残基的作用在全酶功能中的透彻了解将促进有效抑制剂的进一步开发。为了探究该残基侧链的大小对于全酶功能的影响,我们的前期研究将Trp21残基突变为性质相似但是侧链更小的His残基,酶动力学测试发现,突变导致酶DHFR-W21H的催化常数Kcat随pH的变化与野生型DHFR相比明显不同,在pH＜6.0时,DHFR-W21H与野生型DHFR都保持着酶催化活性,而在接近pH7.0时,DHFR-W21H却几乎完全丧失催化活性,而这时野生型DHFR仍然具有较强的酶催化活性。我们猜测导致这一结果的原因可能是由于突变为较小残基后构象发生改变,所以我们使用核磁共振技术对突变体DHFR-W21H-MTX复合物在两个不同pH值(pH5.8和7.5)下的蛋白质溶液结构进行了研究。结果表明:(1)DHFR-W21H在pH5.8和pH7.5条件下都类似于野生型.DHFR的结构,即主要由8个β-折叠,4个α-螺旋,和两段长的loop,即A-B loop(残基9-23)和F-G loop(残基119L-135)形成相似的拓朴结构。(2)位于A-B loop上的残基Pro20-Lcu23片段在溶液中存在着构象交换,具有两种较稳定的可观测构象,并且,残基Pro20-Leu23片段的动力学行为在pH5.8和p87.5的DHFR-W21H-MTX复合物中不相同。(3)突变导致了空间上靠近Trp21残基的局部区域受到了扰动,使A-B loop和F-G loop稳定性明显下降,柔性增强。(4)His21侧链咪唑环的质子化可能与酶DHFR-W21H的催化紧密相关。这些结论提示Trp21残基在全酶中的作用不是维持整体拓朴结构,而是在于以其较大的侧链与活性中心的两个loop上的残基作用,使之趋于稳定,从而维持催化活性。同时。这一研究结果证实了另一个猜测,即DHFR的A-B loop和F-G loop稳定性直接与酶的催化活性相关。