靶向VEGF基因的siRNA和树突状细胞对乳腺癌MCF-7细胞作用的体外研究

摘要

目的：血管新生和免疫受抑是肿瘤发生的重要生物学机制。肿瘤患者体内多存在免疫缺陷或功能受损，肿瘤细胞通过多种细胞和分子机制逃避机体的抗肿瘤免疫反应，其中树突状细胞(DC)分化异常和对T细胞刺激能力的下降是导致肿瘤免疫逃逸的重要因素。血管内皮生长因子(VEGF)是主要的促血管新生因子，肿瘤细胞过量分泌的VEGF除了具有促血管新生活性外，还可通过抑制造血祖细胞来源的DC的分化而发挥免疫抑制作用。基于VEGF促血管新生活性和免疫抑制的双重作用，本研究拟应用siRNA阻断VEGF活性达到抗肿瘤血管新生的同时改善肿瘤免疫状态，同时应用体外诱导正常DC的联合抗瘤作用，观察这种联合是否能够增强体外抗瘤效果，为临床抗肿瘤血管新生联合DC免疫治疗提供实验依据。 方法：以MCF-7乳腺癌细胞为观察对象，体外设计合成靶向VEGF的siRNA，采用siRNA技术靶向抑制MCF-7细胞VEGF基因的表达，观察siRNA基因沉默效果及对靶细胞的影响；分离正常人外周血单个核细胞(PBMC)，在一定细胞因子组合下诱导、培养DC;模拟肿瘤体内环境，添加MCF-7乳腺癌细胞培养上清培养DC，观察MCF-7乳腺癌细胞培养上清对正常外周血单个核细胞诱导的DC分化、成熟及功能的影响，探讨肿瘤机体内DC的免疫抑制状态；观察VEGF下调后MCF-7乳腺癌细胞培养上清对正常外周血单个核细胞诱导的DC分化、成熟及功能的影响的变化，探讨阻断VEGF活性对于改善DC功能的作用；进一步探讨靶向MCF-7细胞VEGF基因的siRNA和负载肿瘤抗原的DC二者联合对MCF-7细胞的抗瘤效果。 结果：设计合成的siRNA转染MCF-7细胞后VEG.mRNA和蛋白表达水平明显减低，同时抑制了靶细胞的增殖；在体外应用粒-巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)，白介素-4（IL-4）及肿瘤坏死因子α(TNF-α)能有效培养人外周血单个核细胞来源的DC.MCF-7乳腺癌细胞培养上清能够明显抑制正常外周血单个核细胞诱导的树突状细胞的分化成熟及抗原提呈能力，CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达明显降低(p<0.01)，DC致敏的CTL对MCF-7细胞杀伤活性及IL-12分泌和共刺激T淋巴细胞所分泌的IFN-γ明显降低(p<0.01)；干扰VEGF基因后MCF-7乳腺癌细胞，培养上清对DCs的影响明显降低，CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达显著升高，DC致敏的CTL对MCF-7细胞杀伤活性及IL-12分泌和共刺激T淋巴细胞所分泌的IFN-γ明显升高(P<0.01)；靶向VEGF基因的siRNA和DC联合应用可显著抑制肿瘤细胞生长，细胞几乎完全溶解，细胞杀伤率达99％。 结论：体外设计合成的双链siRNA能有效抑制乳腺癌MCF-7细胞VEGF基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡；MCF-7乳腺癌细胞上清明显抑制外周血单个核细胞诱导培养的树突状细胞的分化、成熟及抗原提呈能力。下调VEGF后的MCF-7细胞上清对DCs的分化、成熟及功能的抑制作用明显降低，从而推测VEGF在肿瘤的发生、发展和免疫抑制方面可能起着重要的作用；应用siRNA联合负载肿瘤抗原DC能有效抑制乳腺癌MCF-7细胞的生长，为该课题进一步的体内实验和临床应用基因治疗联合免疫治疗提供理论基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分siRNA对人乳腺癌MCF-7细胞VEGF的影响

1. 实验材料

1.1细胞株及培养体系

1.2药品与试剂

1.3材料与仪器

2. 实验方法

2.1主要溶液的配制

2.2细胞株培养

2.3实验分组及处理

2.4体外转录合成siRNA

2.5转染方法

2.6 MTT测细胞增殖

2.7 Hoechst33258核染色

2.8 RNA提取与RT-PCR

2.9 Westblot检测MCF-7细胞VEGF蛋白表达

2.10统计学处理

3. 结果

3.1 siRNA对肿瘤细胞生长抑制作用

3.2 VEGF mRNA表达的变化

3.3 VEGFsiRNA对MCF-7细胞靶蛋白表达的影响

4. 讨论

第二部分人树突状细胞的培养及鉴定

1.材料

1.1材料

1.2主要试剂

1.3细胞因子的分装

1.4实验仪器

2.方法

2.1树突状细胞的诱导与培养(采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法)

2.2 DC鉴定

3.结果

3.1 DC的形态

3.2流式细胞仪检测DC表面分子的表达

4.讨论

第三部分乳腺癌细胞培养上清对DC分化、成熟及功能的影响

1.材料和方法

1.1材料

1.2主要试剂

1.3主要溶液的配制

1.4主要仪器及耗材

2.实验方法

2.1 MCF-7细胞培养上清液的收集与不同诱导体系的制备

2.2外周血来源树突状细胞(PBDC)的体外诱导培养

2.3实验分组

2.4细胞形态学鉴定

2.5 FCM法检测DC特异性表面分子表达

2.6 MTT法检测单向同种异体混合淋巴细胞反应

2.7 ELISA法检测MLR上清中IFN-γ的分泌水平

2.8 ELIsA法检测DC培养上清液中IL-12的分泌水平

2.9 负载肿瘤抗原的DC和致敏CTL的制备

2.10 MTT法检测树突状细胞介导的CTL细胞的肿瘤杀伤效应

2.11 Hochest 33258荧光染色CTL靶细胞的凋亡

2.12统计方法

3.结果

3.1树突状细胞形态

3.2树突状细胞的免疫表型

3.3树突状细胞致敏的CTL肿瘤杀伤效应

3.4各组单向同种异体混合淋巴细胞反应水平检测

3.5不同诱导体系培养DC上清液IL-12水平测定

3.6各组MLR上清液中IFN-Y分泌量的测定

4.讨论

四部分应用siRNA技术探讨MCF-7乳腺癌细胞分泌的VEGF对树突细胞的影响

1.材料与方法

1.1材料

2.实验方法

2.1靶向VEGF基因的siRNA设计合成

2.2转染

2.3 Western blotting检测VEGF蛋白的表达

2.4 ELISA法检测MCF-7乳腺癌细胞培养上清VEGF蛋白水平

2.5 MCF-7细胞不同诱导体系培养上清液的收集

2.6外周血来源树突状细胞(PBDC)的体外诱导培养

2.7实验分组

2.8流式细胞仪检测树突细胞的成熟率

2.9负载肿瘤抗原的CTL的制备

2.10 MTT法检测树突细胞介导的CTL的肿瘤杀伤效应

2.11 ELISA法检测IL-12检测

2.12 ELISA法检测MLR上清中IFN-γ的分泌水平

2.13统计学处理

3.结果

3.1培养上清中VEGF蛋白水平

3.2 VEGF siRNA对MCF-7细胞靶蛋白表达的影响

3.3树突细胞形态改变

3.4树突细胞的成熟率

3.5 MTT法检测树突状细胞介导的CTL细胞的肿瘤杀伤效应

3.6 IL-12检测

3.7各组MLR上清液中IFN-Y分泌量的测定

4.讨论

第五部分VEGF联合负载肿瘤抗原的树突状细胞抗乳腺癌的体外研究

1.材料与方法

1.1试剂

1.2主要实验仪器

2.实验方法

2.1 VEGF siRNA设计合成

2.2外周血来源树突状细胞(PBDC)的体外诱导培养

2.3负载肿瘤抗原的CTL的制备

2.4 MTT法检测树突细胞介导的CTL的肿瘤杀伤效应

2.5 Hochest 33258荧光染色CTL靶细胞的凋亡

2.6统计学处理

3.结果

3.1 MTT法检测树突状细胞介导的CTL细胞的肿瘤杀伤效应(%)

3.2 CTL肿瘤杀伤效应(Hochest33258)

4.讨论

结语

参考文献

综述

综述一VEGF与肿瘤

综述二树突状细胞与乳腺癌

参考文献

攻读学位期间的研究成果

附录 英中文对照及部分缩略词

致谢