利用RNA干扰技术抑制人大肠癌RKO细胞系葡萄糖调节蛋白78表达的实验研究

摘要

[目的]：构建GRP78靶向shRNA质粒表达载体(PGPU6/GFP/Neo-GRP78，shRNA-GRP78)，观察其对人大肠癌RKO细胞系GRP78基因表达及对细胞增殖、转移、凋亡生物学行为的影响。
　　 [方法]：使用脂质体Lipofectamine2000将GRP78靶向shRNA质粒表达载体( shRNA-GRP78)转入人大肠癌RKO细胞系内，经G418筛选出稳定转染的阳性细胞。分别通过荧光定量PCR和Western-blotting技术检测RKO细胞系中GRP78在mRNA和蛋白水平上的表达变化，挑选出表达抑制最强的稳定转染细胞系。通过xCELLigence系统检测细胞的增值、迁移能力；流式细胞术检测细胞凋亡变化情况。
　　 [结果]：GRP78靶向shRNA质粒表达载体(shRNA-GRP78)可以显著下调GRP78mRNA及蛋白表达水平(P<0.05); GRP78基因的表达下调显著抑制RKO细胞的体外增殖，并显著增加RKO细胞的凋亡率(P<0.05)；但GRP78基因的表达下调未影响RKO细胞的体外迁移能力。
　　 [结论]：GRP78靶向shRNA质粒表达载体(shRNA-GRP78)能明显抑制大肠癌RKO细胞系GRP78 mRNA及蛋白的表达，抑制细胞的生长增殖，诱导细胞凋亡。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一章 实验材料及试剂

1.1 仪器设备

1.2 试剂

1.3 常用缓冲液、培养液等溶液的试剂配方

1.3.1 细胞培养相关试剂

1.3.2 RT-PCR相关试剂及缓冲液

1.3.3 Western-blotting相关试剂

第二章 实验方法及项目

2.1 shRNA质粒表达载体的构建

2.2 细胞培养

2.2.1 实验细胞

2.2.2 细胞传代

2.2.3 细胞冻存

2.2.4 细胞复苏

2.3 实验分组

2.4 稳定转染

2.5 基因抑制效率的检测

2.5.1 半定量RT-PCR及荧光定量PCR检测GRP78 mRNA水平的表达

2.5.2 Western blotting检测GRP78蛋白的表达

2.6 干扰效应分析

2.6.1 Annexin V-FITC/PI

2.6.2 细胞增殖、迁移实验

2.7 数据统计分析方法

第三章 实验结果

3.1 shRNA-GRP78对GRP78 mRNA表达的抑制情况

3.1.1 半定量RT-PCR检测结果

3.1.2 荧光定量PCR检测结果

3.2 shRNA．GRP78对GRP78蛋白表达的抑制情况

3.3 流式细胞仪检测细胞凋亡结果

3.4 xCELLigence系统检测细胞增殖能力结果

3.5 xCELLigence系统检测细胞迁移能力结果

第四章 讨论

结论

参考文献

附图

综述

综述参考文献

攻读学位期间的研究成果

缩略语

致谢