眼内Foxp3+Treg细胞的上游信号调控机制及其与眼免疫赦免的关系

摘要

目的:
　　 研究小鼠眼内Foxp3+CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell，Treg细胞)的形成机理以及其上游信号开关c-Rel调控小鼠眼内Treg细胞形成的机制，进一步揭示Treg细胞参与眼免疫赦免的发生机理。
　　 方法:
　　 (一)、眼微环境诱导Treg细胞形成的研究
　　 1)体外实验分析Treg细胞是否可以被房水诱导形成：应用野生型(WT)B6小鼠眼房水(3.0×)，用于体外培养naive CD4+细胞，同时应用不同浓度TGFB-1(0ng/ml、0.5 ng/ml、1ng/ml、4ng/ml、20ng/ml、100ng/ml TGFβ-1)体外培养naive CD4+细胞，Foxp3、CD4、CD25三重染色后，流式细胞仪分析以上各组Treg细胞的百分率，分析以上各组Foxp3平均荧光强度(Mean fluorescence intensity，MFI)数值的区别。
　　 2)体内实验分析Treg细胞是否可以在眼内被诱导形成：应用OVA-TCR-Tg B6小鼠，眼内注射OVA，应用流式细胞仪技术检测不同时间模型眼Treg细胞占眼内CD4+细胞的百分率，并与外周血、脾脏、引流淋巴结Treg细胞百分率进行比较，分析眼微环境是否能诱导Treg细胞形成。
　　 (二)、眼内Treg细胞形成上游c-Rel信号通路的研究
　　 1)体外实验应用WTB6小鼠眼房水，分别培养c-Rel基因敲除/B6小鼠naive CD4+细胞与WTB6小鼠naive CD4+细胞，Foxp3、CD4、CD25三重染色后，流式细胞仪分析以上各组Treg细胞的百分率，观察不同组间Treg细胞形成率的区别。
　　 2)体内实验应用c-Rel基因敲除/OVA-TCR-Tg/B6小鼠，眼前房内注射OVA，模型建立后不同时间，应用流式细胞仪技术检测Treg细胞、Th17细胞占眼内CD4+细胞的百分率，并与非基因敲除鼠葡萄膜炎模型进行对比。并同时应用real-time PCR检测的Foxp3 mRNA、IL-17 mRNA表达量在c-Rel基因敲除后的变化。
　　 (三)、c-Rel信号通路与角膜移植术后免疫斥反应关系的初步研究
　　 建立异系小鼠穿透性角膜移植术(PKP)模型。Real-time RT-PCR检测排斥组与未排斥组眼内Foxp3mRNA、Th17mRNA、c-rel mRNA表达水平的变化。分析c-rel信号通路与Treg细胞、Th17细胞形成的关系。
　　 结果:
　　 (一)体外实验显示3.0×房水培养组Foxp3+Treg细胞百分率为8.4％±1.2％，3.0×房水诱导Treg细胞形成的能力约等于0.5 ng/ml TGFβ-1组，但是其Foxp3+的MFI却高达70±2，超过了20ng/ml TGFβ-1组(MFI=66±3)。WT小鼠眼内含有极微量的CD4+T细胞，其中Treg细胞占CD4+T细胞百分率为5.4％±0.2％，引流淋巴结中Treg细胞百分率为8.2±1.6％。体内试验显示眼前房注射OVA后2天、4天、6天眼内Treg细胞百分率分别为：60.2％±3.5％、32.2％±2.8％、28.4％±2.2％，引流淋巴结内Treg细胞百分率分别为：5.8％±0.8％、5.1％±0.6％，3.8±0.3％。注射前后眼内Treg细胞百分率较注射前显著增长(p<0.05)，注射后眼内Treg细胞百分率远高于淋巴结内Treg细胞百分率(p<0.05)。
　　 (二)体外实验显示6×房水在培养48小时后诱导形成了Treg细胞，WT组Treg细胞百分率为2.4％±0.3％，c-Rel-/-组Treg细胞百分率为1.0％±0.2％，两组差异具有统计学意义(p<0.05)。同期空白对照组几乎不能产生Treg细胞。体内实验显示c-Rel基因敲除后眼内形成的Treg细胞，Th17细胞均发生了下降(p<0.05)。应用real-time PCR检测的Foxp3 mRNA与IL-17 mRNA在cRel基因敲除后也发生了显著的降低(p<0.01)。
　　 (三)异系PKP组排斥眼IL-17mRNA与Foxp3mRNA含量均较未排斥组明显增高，分析IL-17mRNA/Foxp3mRNA的比率，可以发现此比率在未排斥组(0.25)低于排斥组(0.57)。原位移植组IL-17mRNA/Foxp3mRNA的比率均处在较低的水平。c-RelmRNA的表达量的变化趋势与Foxp3mRNA变化趋势相同。IL-17mRNA/Foxp3mRNA的比率降低时c-RelmRNA的表达量也降低。
　　 结论:
　　 眼内发生免疫应答反应时会形成较多CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞，这些Treg细胞并不单纯来自于引流淋巴结，而是在眼内特殊免疫微环境中被诱导产生；眼部微环境诱导的Treg细胞其Foxp3的免疫抑制功能较强，这很可能是眼具有免疫赦免功能的重要原因。c-Rel是调控眼内Treg细胞形成的重要的上游信号通路，参与调节眼免疫赦免。