海藻糖对胸骨低温保存的保护作用及其机制的初步研究

摘要

实验一、海藻糖对低温保存不同时间的胸骨组织ALP活性及3H-TdR掺入的影响
　　 目的:探讨海藻糖对低温保存不同时间的胸骨组织ALP活性及3H-TdR掺入的影响，了解海藻糖在低温下对胸骨细胞活力的保护作用。
　　 方法:新鲜配制两组保存液，其中：Ⅰ组LPD+10％DMSO，Ⅱ组LPD+10％DMSO+0.10mol/L海藻糖。切取SD大鼠胸骨后立即含有放入上述两种溶液的冻存管低温保存，随机抽取新鲜胸骨组织和低温保存1d、15d、30d、60d、120d后的胸骨组织进行体外培养，上清液进行ALP活性检测；剩余部分加入3H-TdR做标记，检测胸骨组织细胞3H-TdR掺入率。
　　 结果:低温保存不同时间后，Ⅱ组胸骨上清液ALP活性检测(95.14％～71.85％)，明显高于Ⅰ组(85.63％～69.66％)；Ⅱ组胸骨组织细胞3H-TdR掺入率(98.86％～81.02％)，明显高于Ⅰ组(94.45％～74.46％)，这种趋势持续到低温保存120天。
　　 结论:海藻糖在胸骨低温保存中对组织细胞有明显的保护作用；检测胸骨培养液上清中ALP活性及胸骨3H-TdR掺入率的方法可以比较客观地反映了器官保存后组织细胞的活力。
　　 实验二、不同海藻糖浓度对胸骨低温保存活性的影响
　　 目的:探讨不同海藻糖浓度对胸骨低温保存活性的影响。
　　 方法:新鲜配制四组保存液，均含10％DMSO，分别加入不同浓度海藻糖：Ⅰ组0.05mol/L，Ⅱ组0.10mol/L，Ⅲ组0.20mol/L，Ⅳ组0.30mol/L。切取SD大鼠胸骨后立即放入含有上述四种溶液的冻存管低温保存，随机抽取新鲜胸骨组织和低温保存120d后的各组胸骨组织体外培养，上清液进行ALP活性检测；剩余部分加入3H-TdR做标记，检测胸骨组织细胞3H-TdR掺入率。
　　 结果:低温保存120d后胸骨组织培养上清中ALP活性和胸骨组织细胞3H-TdR掺入率与新鲜对照组比较均有下降(p<0.05)，其中以Ⅰ组下降较为明显，而Ⅲ组下降较少。
　　 结论:海藻糖在0.20 mol/L浓度下对骨骼的保护作用较好。
　　 实验三、保护机制研究：海藻糖对低温保存的胸骨中Bcl-2和Bax基因表达的影响及相关研究
　　 目的：探讨海藻糖对低温保存120天的胸骨组织的Bcl-2及Bax基因表达的影响，进一步证实海藻糖对低温保存胸骨的保护作用。
　　 方法：新鲜配置保存液4组：Ⅰ组LPD(低钾右旋糖酐)液；Ⅱ组LPD+10％DMSO(二甲基亚砜)；Ⅲ组LPD+0.20 mol/L海藻糖；Ⅳ组LPD+10％DMSO+0.20mol/L海藻糖；切取SD大鼠胸骨后立即分别放入含上述4种溶液的冻存管中低温保存，随机抽取新鲜胸骨组织和低温保存120d的4组标本，采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测不同保存液保存120d的胸骨及新鲜胸骨的Bcl-2和Bax基因的mRNA表达量。
　　 结果：在冻存组中，Ⅲ组的Bcl-2表达量与Ⅰ、Ⅱ组比较有增高(p<0.01)；Ⅳ组的Bcl-2表达量最高，基本接近新鲜骨组织，与新鲜组织比较差异无统计学意义(p>0.05)；在冻存组中，Ⅲ组的Bax的表达量与Ⅰ、Ⅱ组比较有减低(p<0.01)；Ⅳ组的Bax表达量最低，基本接近新鲜骨组织，与新鲜组织比较差异无统计学意义(p>0.05)。
　　 结论：海藻糖对低温保存中的胸骨细胞活性具有保护作用；通过增强Bcl-2基因、抑制Bax基因的表达来抑制胸骨细胞凋亡可能是其保护机制之一；海藻糖和DMSO合用保护作用更好。