三氧化二砷抑制腺样囊性癌ACC-2细胞生长、诱导其凋亡的基因表达谱及其分子机制研究

摘要

目的：
　　 本研究拟:(1)研究观察三氧化二砷(arsenictrioxide,As2O3)对腺样囊性癌(adenoidcysticcarcinoma,ACC)细胞株ACC-2细胞的生长抑制作用,探讨其诱导ACC-2细胞凋亡的作用机制。(2)检测As2O3药物作用前、后的ACC-2细胞的基因表达谱变化,筛选诱导ACC-2细胞凋亡的相关基因。(3)探讨凋亡相关基因bcl-2、c-myc在As2O3诱导ACC-2细胞凋亡中的作用,验证基因芯片的基因表达谱检测结果,探讨As2O3诱导腺样囊性癌ACC-2细胞凋亡的分子机制,为临床合理应用As2O3药物提供理论依据。(4)探讨hTERT在As2O3诱导ACC-2细胞凋亡巾的作用。(5)探讨线粒体膜电位(△ψm)、Caspase3在As2O03诱导ACC-2细胞凋亡中的作用。
　　 材料与方法：
　　 (1)进行ACC-2细胞培养,将As2O3建立不同药物浓度梯度(0、1.0、2.0、4.0、8.0μmol/L)分别作用于ACC-2细胞,在倒置相差显微镜下动态观察培养板中不同浓度As2O3处理前后ACC-2细胞的形态变化,并照相记录;分别在药物作用后24h、48h、72h行MTT染色,酶标仪测得吸光度OD值,计算细胞生长抑制率:行Hoechst33342/PI双染免疫荧光染色,AnnexinV-PI双染行流式细胞术分析细胞凋亡率,PI染色行流式细胞术检测DNA含量与细胞周期:用透射电子显微镜观察As2O3作用于ACC-2细胞前后的细胞超微结构变化。(2)应用基因芯片技术检测As2O3药物作用前、后的ACC-2细胞的基因表达谱变化,运用生物信息学分析差异基因的功能网络,获得显著表达差异的候选基因。(3)应用RT-PCR和WesternBlot方法,检测As2O3作用前、后,ACC-2细胞的凋亡相关基因bcl-2、c-myc的mRNA水平和蛋白水平的表达。(4)应用RT-PCR方法,检测.As2O3作用前、后,ACC-2细胞的hTERT的mRNA水平表达。(5)用Rh123染色,流式细胞仪检测8.0μmol/LAs2O3作用前、后(24h),ACC-2细胞的线粒体膜电位(△ψm)变化;用多功能酶标仪进行Caspase3活性检测。
　　 结果：
　　 (1)As2O3可抑制腺样囊性癌ACC-2细胞生长,且抑制作用呈现时间-剂量依赖关系;免疫荧光染色观察到随As2O3药物浓度增高,作用时间延长,细胞核被染成强蓝色的凋亡细胞越来越多;透射电子显微镜下的超微结构观察结果,可见ACC-2细胞有部分呈现凋亡的形态,细胞体积缩小,细胞核浓聚缩小,核内出现透明区,核仁消失,核空泡化,染色质固缩,聚集于核膜下,染色质或凝集成团块状部分并附着在核膜下,或染色质边聚,形成新月状,细胞器减少,细胞浆浓缩,或裂解成质膜包绕的染色质碎片(凋亡小体);流式细胞术结果显示,随As2O3药物作用浓度的增加,ACC-2细胞的凋亡率逐渐增高:除低浓度组(1.0μmol/L)外,其余药物浓度组(2.0、4.0、8.0μmol/L)与对照组相比,其差异有显著性(P＜0.05):药物作用组均可检测到亚G1期凋亡峰,但低浓度组(1.0、2.0μmol/L)的凋亡峰不明显,高浓度组(4.0、8.0μmol/L)的亚G1期凋亡峰明显;4.0、8.0μmol/l的As2O3作用48h后,ACC-2细胞G2-M期细胞数明显增多,与对照组相比,分别上升30.23%和33.43%。(2)As2O3作用于ACC-2细胞后,其基因表达谱发生了较大的变化,有1160个基因显著上调表达;1084个基因显著下调表达。(3)RT-PCR结果显示,在未经药物作用、作为对照组的正常培养的ACC-2细胞中,bcl-2、c-myc的mRNA呈王见明显高表达;在As2O3作用于ACC-2细胞后24h与48h时,随As2O3药物浓度的增高(1.0μmol/L、2.0μmol/L、4.0μmol/L、8.0μmol/L),bcl-2、c-myc的mRNA表达逐渐降低。WesternBlot结果显示,在未经药物作用、作为对照组的正常培养的ACC-2细胞中,bcl-2、c-myc蛋白呈现明显高表达;在As2O3作用于ACC-2细胞后24h与48h时,随As2O3药物浓度的增高(1.0μmol/L、2.0μmol/L、4.0μmol/L、8.0μmol/L),bcl-2、c-myc蛋白表达逐渐降低,与mRNA表达变化趋势相一致。(4)RT-PCR结果显示,在未经药物作用、作为对照组的正常培养的ACC-2细胞中,hTERT的mRNA呈现明显高表达;在As2O3作用于ACC-2细胞后24h与48h时,随As2O3药物浓度的增高(1.0μmol/L、2.0μmol/L、4.0μmol/L、8.0μmol/L),hTERT的mRNA表达逐渐降低。(5)空白对照组ACC-2细胞内Rh123荧光强度最强,8.0μmol/LAs2O3治疗组ACC-2细胞内Rh123荧光强度减弱,其差异有显著性(P＜0.05);随着As2O3药物浓度的增高(0μmol/L,1μmol/L,2μmol/L,4μmol/L,8μmol/L),ACC-2细胞的Caspase3酶活力单位逐渐增加。
　　 结论：
　　 (1)As2O3可抑制腺样囊性癌ACC-2细胞生长,主要是通过诱导ACC-2细胞凋亡来实现的:As2O3作用于ACC-2细胞后,细胞呈现出典型的凋亡形态学改变,可以检测到亚G1期凋亡峰,细胞于G2/M期阻滞,细胞凋亡率随As2O3药物浓度的增高而逐渐增高。(2)As2O3作用于ACC-2细胞后,其基因表达谱发生了较大的变化,与凋亡相关的基因变化明显。(3)As2O3通过下调ACC-2细胞的bcl-2、c-myc、hTERT的mRNA转录表达及bcl-2、c-myc的蛋白表达,来诱导ACC-2细胞凋亡。(4)As2O3作用于ACC-2细胞,可通过降低线粒体膜电位从而引起细胞凋亡。随着As2O3药物浓度的增高,ACC-2细胞的Caspase3酶活力单位逐渐增加,Caspase3被激活,细胞随即发生不可逆转的凋亡过程。(5)As2O3诱导腺样囊性癌ACC-2细胞凋亡,至少通过早期下调bcl-2和c-myc的上游mRNA转录表达及下游蛋白表达,同时正相调节hTERT的mRNA转录表达下调,bcl-2蛋白表达抑制,线粒体膜电位下降甚至耗散,从而可造成线粒体外膜通透性增高,MPTP开放,促进CytC的释放,激活效应Caspase3,从而发生细胞凋亡,细胞阻滞于G2/M期。As2O3诱导ACC-2细胞凋亡,可能是通过痛基因、抑基因、蛋白酶类的多步骤、多因素参与的复杂过程,通过立体交叉网状的信号转导通路来实现的。