中药复方对胃粘膜细胞癌变的抑制与逆转作用研究

摘要

胃癌发生发展的过程很少直接从胃粘膜上皮产生，而是由多基因异常引起的渐进性的变化，在癌变前多数经历了较长的演变，即由正常胃粘膜转变成为癌前病变，部分发展成胃癌。胃黏膜的肠上皮化生及不典型型增生主要存在于慢性萎缩性胃炎，虽然不典型型增生是公认的癌前病变，有发展成肿瘤细胞的潜在趋势，但是癌前病变是一个多步骤、多因素的复杂过程，不是所有的癌前病变都会发展成为胃癌，有的可以在进程中停止发展，甚至发生逆转或消失。此中药复方由雪胆、老龙皮、白术、半枝莲、海螵蛸、黄芪组成。全方针对性强，配伍严谨，符合中医药的“未病先防”思想，对胃癌癌前病变的预防和治疗有非常重要意义。
　　 本文利用亚硝胺类化合物成功诱导出了胃癌癌前病变的细胞模型，并进行了癌变相关蛋白的检测，借助免疫印迹，实时荧光定量RT-PCR等生物学检测方法评价了中药复方对癌前病变的细胞株以及恶性程度较高的细胞株中相关分子的影响，初步探究了其抑制和逆转胃黏膜细胞癌变的作用。
　　 一、亚硝胺类化合物MNNG诱导GES-1细胞模型的建立
　　 使用与胃癌相关的亚硝胺类化合物N-甲基-N'硝基N-亚硝基胍(MNNG)对永生化的人胃粘膜上皮细胞系GES-1进行恶性转化实验，得到转化后细胞，称为MC细胞。比较观察GES-1细胞和MC细胞的形态，检测癌变相关蛋白N-cadherin，P-STAT3的表达。经MNNG处理后的GES-1细胞（命名为MC），细胞的形态以及生长特性均发生了改变。随传代的延续，细胞呈现典型的“岛样”克隆生长。癌变相关蛋白N-cadherin，P-STAT3的表达量增加。
　　 二、中药复方对MNNG诱导GES-1细胞恶性转化的抑制作用
　　 SRB法检测中药复方对GES-1细胞的细胞毒作用，免疫印迹检测中药复方对MNNG诱导的GES-1细胞中癌变相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、P-STAT3表达的影响，实时荧光定量RT-PCR检测中药复方对MNNG诱导的GES-1细胞中Snail，Twist基因的影响。SRB法检测结果显示，中药复方对GES-1细胞有一定的生长抑制作用，说明中药复方在体外具有一定的抗肿瘤细胞增殖的活性，从中选出合适的给药浓度。进一步研究发现中药复方下调MNNG诱导的GES-1细胞中癌变相关蛋白N-cadherin，P-STAT3表达的影响，上调了E-cadherin的表达。实时荧光定量RT-PCR分析中药复方对MNNG诱导的GES-1细胞Snail，Twist的mRNA表达产生了一定的抑制作用。
　　 三、中药复方对MGC-803细胞恶性程度的逆转作用
　　 MTT法检测中药复方对MGC-803细胞的细胞毒作用，划痕法检测中药复方对MGC-803细胞迁移的影响，Transwell侵袭实验检测中药复方对MGC-803细胞侵袭力的影响，克隆形成实验检测中药复方对MGC-803细胞克隆形成能力的影响，软琼脂实验检测中药复方对MGC-803细胞非锚着依赖性生长的影响，免疫印迹检测中药复方对MGC-803细胞中癌变相关蛋白N-cadherin，P-STAT3表达的影响，实时荧光定量RT-PCR检测中药复方对MGC-803细胞中Snail，Twist基因的影响。MTT法检测结果显示，中药复方对MGC-803细胞有一定的生长抑制作用，说明中药复方在体外具有一定的抗肿瘤细胞增殖活性，从中选出合适的给药浓度。划痕实验，Transwell侵袭实验，克隆形成实验，软琼脂实验表明中药复方对MGC-803细胞迁移、侵袭、克隆形成以及非锚着依赖性生长都产生了较好的抑制作用，进一步研究发现中药复方下调了MGC-803细胞中癌变相关蛋白N-cadherin，P-STAT3表达。实时荧光定量RT-PCR分析，中药复方对MGC-803细胞Snail，Twist的mRNA表达产生了一定的抑制作用。
　　 本论文综合利用现代药理学和分子生物学检测方法，成功建立了MNNG诱导的GES-1细胞模型。初步探讨了中药复方对于胃癌癌前细胞株以及恶性程度较高的癌细胞株的作用，揭示了此中药复方对胃黏膜细胞癌变的抑制与逆转作用，为此复方合理开发利用提供了科学的依据。

目录

摘要

引言

第一章 亚硝胺类化合物MNNG诱导GES-1细胞恶性转化细胞模型的建立

1．1 实验材料

1．1．1 试剂

1．1．2 仪器与设备

1．1．3 细胞株

1．2 实验方法

1．2．1 GES-1细胞常规培养

1．2．2 亚硝基化合物MNNG诱导GES-1细胞转化

1．2．3 GES-1，MC细胞中癌变相关蛋白N-cadherin，P-STAT3表达的测定

1．3 实验结果

1．3．1 细胞形态学改变

1．3．2 GES-1，MC细胞中癌变相关蛋白N-cadherin，P-STAT3表达的测定

1．3．3 GES-1，MC细胞中癌变相关蛋白P-STAT3表达的测定

第二章 中药复方对MNNG诱导的GES-1细胞恶性转化的抑制作用

2．1 实验材料

2．1．1 试剂

2．1．2 仪器与设备

2．1．3 细胞株

2．2 实验方法

2．2．1 常用缓冲液及其他溶液配制

2．2．2 细胞常规培养

2．2．3 SRB法检测中药复方对GES-1细胞的细胞毒

2．2．4 中药复方对MNNG诱导的GES-1细胞中癌变相关蛋白E-cadherin表达的测定

2．2．5 中药复方对MNNG诱导的GES-1细胞中癌变相关蛋白N-cadherin表达的测定

2．2．6 中药复方对MNNG诱导的GES-1细胞中癌变相关蛋白P-STAT3表达的测定

2．2．7 中药复方对MNNG诱导的GES-1细胞中Twist，Snail基因表达的测定

2．2．8 统计学方法

2．3 实验结果

2．3．1 中药复方对GES-1细胞的细胞毒作用

2．3．2 中药复方对MNNG诱导的GES-1细胞中癌变相关蛋白E-cadherin表达的测定

2．3．3 中药复方对MNNG诱导的GES-1细胞中癌变相关蛋白N-cadherin表达的测定

2．3．4 中药复方对MNNG诱导的GES-1细胞中癌变相关蛋白P-stat3表达的测定

2．3．5 实时荧光定量RT-PCR检测中药复方对MNNG诱导的GES-1细胞中Twist基因的影响

2．3．6 实时荧光定量RT-PCR检测中药复方对MNNG诱导的GES-1细胞中Snail基因的影响

第三章 中药复方对MGC-803细胞的作用机制初探

3．1 实验材料

3．1．1 试剂

3．1．2 仪器与设备

3．1．3 细胞株

3．2．1 常用缓冲液及其他溶液配制

3．2．2 人胃癌细胞系MGC-803的复苏、传代及冻存

3．2．3 MTT法检测中药复方对MGC-803细胞的细胞毒

3．2．4 划痕法检测中药复方对MGC-803细胞迁移的影响

3．2．5 Transwell侵袭实验检测中药复方对MGC-803细胞侵袭力的影响

3．2．6 克隆形成实验检测中药复方对MGC-803细胞克隆形成能力的影响

3．2．7 软琼脂实验检测中药复方对MGC-80-3细胞非锚着依赖性生长的影响

3．2．8 中药复方对MGC-803细胞中癌变相关蛋白N-cadherin表达的测定

3．2．9 中药复方对MGC-803细胞中癌变相关蛋白P-STAT3表达的测定

3．2．10 实时荧光定量RT-PCR检测中药复方对MGC-803细胞Twist，Snail基因的影响

3．2．11 统计学方法

3．3 实验结果

3．3．1 中药复方对MGC-803细胞的细胞毒作用

3．3．2 划痕法检测中药复方对MGC-803细胞迁移的影响

3．3．3 Transwell侵袭实验检测中药复方对MGC-803细胞侵袭力的影响

3．3．4 克隆形成实验检测中药复方对MGC-803细胞克隆形成能力的影响

3．3．4 软琼脂实验检测中药复方对MGC-803细胞非锚定依赖性生长的影响

3．3．5 中药复方对MGC-803细胞中癌变相关蛋白N-cadherin表达的测定

3．3．6 中药复方对MGC-803细胞中癌变相关蛋白P-stat3表达的测定

3．3．7 实时荧光定量RT-PCR检测中药复方对MGC-803细胞Twist基因的影响

3．3．8 实时荧光定量RT-PCR检测中药复方对MGC-803细胞Snail基因的影响

3．4 讨论

结论

参考文献

综述

攻读学位期间的研究成果

致谢

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