先天性甲状腺功能减低症患者PAX8基因突变筛查及致病机理研究

摘要

先天性甲状腺功能减低症（以下简称甲低）是新生儿常见的内分泌性疾病之一，其中甲状腺发育不全导致的甲低占先天性甲低的85％，而甲状腺特异转录因子在胚胎期甲状腺分化和发育中发挥重要作用， PAX8是甲状腺转录因子之一，PAX8蛋白在胚胎早期甲状腺滤泡分化中发挥重要作用，而且对成人甲状腺细胞分化状态的维持也是必需的。PAX8基因突变会导致PAX8蛋白功能异常，从而影响甲状腺发育导致甲低。
　　 迄今为止，在PAX8中发现的突变至少有10个，其中第3、4外显子是突变热点。本实验第一部分对中国山东地区先天性甲状腺功能减低症患者PAX8第4外显子进行基因突变筛查，阐明中国山东地区甲低患者PAX8基因第4外显子突变特点。453例标本来自山东省甲状腺发育不全的先天性甲低患者，从外周血白细胞中提取全基因组DNA扩增PAX8第4外显子，对PCR产物进行直接测序。分析453例PAX8第4外显子测序结果，在1例患者第4内含子发现1个IVS4+83 T＞C突变，在第4内含子区发现1个SNP位点（rs74370449，IVS4+101G/A，变异频率为8.9％），在1例病例中发现1个错义突变c.280G＞A，p.D94N。PAX8基因第4外显子突变率在中国山东地区甲低患者中很低。
　　 PAX8突变导致甲低的致病机理并不清楚。本实验第二部分对本课题组在PAX8中发现的两个突变(c.122G＞T，p.G41V;c.280G＞A，p.D94N)进行功能学研究。构建PAX8野生型和突变型真核表达载体、TPO和TG启动子区荧光素酶报道基因表达载体，接种Hela细胞，转染PAX8野生型或突变型表达载体，同时转染TPO或TG启动子区表达载体，以海肾荧光素酶表达载体为转染内参。转染后48小时，裂解收集细胞，Dual-Luciferase Reporter Assay System测定荧光强度，研究PAX8基因错义突变对TPO、 TG启动子区激活能力的影响;野生型和突变型PAX8真核表达载体分别转染Hela细胞，48h后收集、裂解细胞，提取总蛋白，Western blotting检测PAX8蛋白表达，与野生型比较分析得出突变体PAX8蛋白表达的改变;荧光定量PCR检测PAX8RNA表达量差异。结果表明:两个突变体的表达量都有所下降，D94N对TPO启动子区的激活能力显著下降(P＜0.01)，对TG启动子区激活能力影响不大，与野生型PAX8共转染，对TPO、 TG激活能力，相对于纯合型来说有所提高，但不明显，相对于野生型有所降低;突变体G41V对TPO、TG启动子区激活能力都显著下降(P＜0.01)，与野生型PAX8共转染，对TPO、 TG激活能力，相对于纯合型显著提高(P＜0.01)，相对于野生型有所降低，G41V对野生型PAX8有显性负效应。PAX8表达载体对TPO、 TG启动子区激活能力存在差异，对TG启动子区激活能力不明显，这种差异可能是由TPO、 TG启动子区结构差异导致的。本实验支持PAX8突变导致甲低的显性负效应机制，具体原因有待进一步研究。

目录

摘要

引言

第1章 中国山东地区先天性甲低患者PAX8基因突变筛查

1．1 研究对象

1．2 实验材料

1．3 实验方法

1．3．1 基因组DNA提取

1．3．2 PCR扩增PAX8基因第4外显子

1．3．3 PCR产物测序

1．4 实验结果

1．5 讨论

1．6 结论

第2章 PAX8突变导致甲低的机研理究

2．1 实验器材、试剂

2．2 载体构建

2．2．1 PAX8-WT-pMD19-T载体构建

2．2．2 WT、D94N、G41V-pCDNA3．1表达载体构建

2．2．3 TPO、TG启动子区荧光素酶报道基因载体构建

2．3 PAX8基因突变对PAX8功能影响

2．3．1 荧光定量PCR检测RNA表达量差异

2．3．2 Western Blotting检测蛋白表达量差异

2．3．3 双荧光素酶报道基因系统分析基因突变对PAX8激活能力的影响

2．4 实验结果

2．4．1 载体构建

2．4．2 荧光定量PCR检测RNA表达量差异

2．4．3 Western Blotting检测PAX8蛋白表达量差异

2．4．4 双荧光素酶报道基因系统分析基因突变对PAX8激活能力的影响

2．5 讨论

2．6 结论

结论

参考文献

综述

攻读学位期间的研究成果

附录

致谢

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