帕金森病铁代谢异常的脑区差异和细胞易感性差异研究

摘要

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是最常见的中枢神经系统退行性疾病之一，仅次于阿尔茨海默症(Alzheimer's disease，AD)。临床表现主要包括静止性震颤、运动迟缓、肌僵直和姿势步态障碍等运动症状，同时患者可伴有抑郁和睡眠障碍等非运动症状。其主要病理改变为黑质(substantia nigra, SN)多巴胺(dopamine，DA)能神经元的变性死亡，由此而引起的纹状体DA含量显著性减少。目前，PD的确切病因仍不清楚，包括遗传因素和非遗传因素。非遗传因素中，氧化应激、线粒体功能障碍、炎症、蛋白异常聚集、凋亡、铁的过度沉积等均可能参与了PD多巴胺能神经元的变性死亡过程。在这些病因中，铁的异常聚集越来越受到研究人员的关注，之前大多研究都把焦点放到了黑质本身，很少关注其他脑区的铁代谢情况。而黑质过多的铁究竟来源于哪里？是否来源于其他脑区？本研究在正常人和PD病人死后的脑组织中，应用ICP方法，测定了大脑颞叶皮层铁、锰、镍和铜四种过渡金属元素的含量，并且应用免疫印记法观察了该脑区铁转运相关蛋白，二价金属离子转运蛋白-1(divalent metal transporter1，DMTl)，转铁蛋白受体-1(transferrin receptor1，TfRl)和铁转出蛋白ferroportin1(FPN1)的表达变化，同时观察了其共同的调节蛋白铁调节蛋白（iron regulatory protein1，IRP1）的变化。同时应用AD脑组织标本作为阳性对照。
　　 血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是一种诱导型应激反应蛋白。尸检结果证实，PD病人SN区的星形胶质细胞和Lewy小体中HO-1水平较正常人明显增高，提示HO-1在PD病理过程中发挥了重要作用。HO-1能够分解血红素生成游离的铁，一氧化碳和胆绿素。后两者在体内有强的还原活性而对细胞起到保护作用，而游离铁可能通过Fenton反应加重氧化应激损伤。目前的研究多集中于HO-1表达调控对细胞的保护性作用，而HO-1在这两种细胞中的表达方式及作用是否有差异，其是否参与了PD中神经元和胶质细胞的不同易感性没有相关研究报道。本实验应用原代细胞培养、免疫印迹、流式细胞术、激光共聚焦扫描技术等多项研究方法，观察了神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+）和α-突触核蛋白处理后，腹侧中脑(ventralmesencephalon，VM)神经元和星形胶质细胞HO-1时间依赖性表达以及HO-1活性改变后两种细胞对神经毒素的易感性，即线粒体跨膜电位差(Mitochondiralmembrane potential，ΔΨm)的变化。研究结果如下:
　　 1、PD组颞叶皮层Fe含量为110.30±3.98 ng/mg，较正常对照组(131.25±7.37ng/mg)相比明显降低，差别有统计学意义(P＜0.05)。AD组无明显变化。Mn、Ni和Cu的含量，PD组和AD组较正常组均无明显变化。
　　 2、PD组颞叶皮层DMT1、TfR1、FPN1、IRP1蛋白表达水平均明显降低，与正常对照组相比，分别降低22.22％、14.23％、21.11％和36.9％。差别有统计学意义(P＜0.05)。AD组无明显变化。
　　 3、100μMMPP+处理体外培养的VM神经元1h、4h、12h、24 h，HO-1蛋白表达水平于24 h时开始升高。5μg/mlα-突触核蛋白处理30 min、2h、4h、12h、24 h、48 h，HO-1表达水平于12h时开始升高，且于24 h到达峰值，48 h下降。
　　 4、100μM MPP+或5μg/mlα-突触核蛋白处理体外培养的星形胶质细胞30min、1h、2h、4h、8h、12h、24 h，HO-1表达水平于1h时开始升高，并于12h到达高峰。
　　 5、100μM MPP+处理VM神经元4h或5μg/mlα-突触核蛋白处理VM神经元1h，细胞的ΔΨm明显降低，较正常对照组相比，差别具有统计学意义(P＜0.05 or0.01)。应用HO-1激活剂原卟啉Ⅸ氯化钴(protoporphyrinⅨ cobalt chloride，Copp)(5μM)预处理24 h，可阻断由MPP+或α-突触核蛋白诱导的ΔΨm的降低，而HO-1抑制剂原卟啉Ⅸ锌(protoporphyrinⅨzinc，Znpp)（5μM）预孵育对MPP+或α-突触核蛋白诱导的ΔΨm的变化没有影响，但可完全阻断Copp的作用。
　　 6、100μM MPP+处理VM星形胶质细胞4h或5μg/mlα-突触核蛋白处理1h，ΔΨm较正常对照组相比均明显降低;与5μM Copp预处理24h后，MPP+或α-突触核蛋白诱导的ΔΨm下降可恢复至接近正常水平;5μM Znpp共孵育使MPP+或α-突触核蛋白诱导的ΔΨm降低更加明显，且可完全阻断Copp对MPP+或α-突触核蛋白的保护作用。
　　 7、100μM MPP+或5μg/mlα-突触核蛋白处理VM神经元24 h，ΔΨm较正常对照组相比均明显降低;5μM Copp预处理24h后，MPP+诱导的ΔΨm降低更加明显，但可以轻微阻断α-突触核蛋白诱导的ΔΨm降低;5μM Znpp共孵育使MPP+或α-突触核蛋白诱导的ΔΨm降低更加明显，但可完全阻断Copp的上述作用。
　　 8、100μM MPP+或5μg/mlα-突触核蛋白处理VM星形胶质细胞24 h，ΔΨm较正常对照组相比均明显降低;MPP+或α-突触核蛋白与Copp共孵育24 h，VM星形胶质细胞ΔΨm恢复至正常水平;5μM Znpp共孵育使MPP+或α-突触核蛋白诱导的ΔΨm降低更加明显，但可完全阻断Copp对MPP+或α-突触核蛋白的保护作用。
　　 9、100μM的MPP+或5μg/ml的α-突触核蛋白处理VM星形胶质细胞12h，ΔΨm较正常对照组相比明显降低;1μMCopp共孵育12 h，可部分阻断MPP+或α-突触核蛋白诱导的ΔΨm下降;5μM Copp共孵育12h，ΔΨm恢复至接近正常水平。
　　 10、10μM和25μM的Copp处理VM神经元48 h，内源性α-突触核蛋白水平较正常对照组相比均明显降低，且25μM组较10μM组相比降低更加明显。
　　 上述结果表明，PD病人大脑皮层颞叶铁水平存在异常，且可能与铁代谢相关蛋白的异常表达有关;MPP+和α-突触核蛋白均可诱导VM神经元和星形胶质细胞中HO-1的表达上调，但星形胶质细胞HO-1的上调明显早于神经元。MPP+和α-突触核蛋白均可诱导VM神经元和星形胶质细胞中ΔΨm的下降。抑制HO-1可加重MPP+和α-突触核蛋白诱导的线粒体损伤。激活HO-1对于星形胶质细胞始终具有线粒体功能的保护性作用，而HO-1的过量表达可加重神经元的损伤。神经元HO-1表达上调会降解内源性α-突触核蛋白。本研究首次证实PD病人颞叶铁及铁代谢相关蛋白水平存在异常，并作出颞叶和主要病变区-黑质之间存在铁的重新分布这一假设，为黑质区异常聚集铁的来源研究提供了一个可能的病理途径。另外，对于细胞易感性的探讨证实，神经毒素MPP+和旺-突触核蛋白诱导的HO-1上调在神经元和星形胶质细胞中具有保护作用。星形胶质细胞中HO-1的更早上调可能是其不易受损的原因。神经元中HO-1的过量表达可能是其更易受损的原因。HO-1的激活可能参与了α-突触核蛋白的降解。本研究首次证实HO-1可能参与了VM神经元和星形胶质细胞对神经毒素的不同易感性，从而为星形胶质细胞HO-1调控在PD神经保护中的作用研究提供了实验基础，为寻找可能的靶向性治疗方案和进一步解释PD中神经元而不是胶质细胞选择性死亡的原因提供实验依据。

目录

摘要

引言

第一章 帕金森病病人颞叶皮层铁代谢研究

摘要

材料和方法

1．1 颞叶皮层金属含量的测定

1．2 颞叶皮层铁代谢相关蛋白表达水平的测定

1．3 统计学处理

结果

1．1 PD病人颞叶皮层铁含量降低

1．2 PD病人颞叶皮层DMT1+IRE、TfR1、FPN1、IRP1蛋白表达水平较正常对照组相比均降低

讨论

第二章 血红素加氧酶-1参与神经元和星形胶质细胞不同易感性的研究

摘要

材料和方法

2．1 腹侧中脑神经元的原代培养

2．2 腹侧中脑星形胶质细胞的原代培养

2．3 免疫荧光方法鉴定腹侧中脑神经元和星形胶质细胞的纯度

2．4 MPP+和α-突触核蛋白处理后VM神经元和星形胶质细胞HO-1蛋白的表达

2．5 细胞线粒体跨膜电位差(mitochondrial transmembrane potential，ΔΨm)的检测

2．6 Copp处理后VM神经元内源性α-突触核蛋白的表达变化

2．7 统计学处理

结果

2．1 免疫荧光技术鉴定原代培养的神经元和星形胶质细胞的纯度

2．2 MPP+／外源性α-突触核蛋白对VM神经元HO-1蛋白表达的影响

2．3 MPP+／外源性α-突触核蛋白对星形胶质细胞HO-1蛋白表达的影响

2．4 HO-1活性改变对MPP+处理的VM神经元和星形胶质细胞ΔΨm的影响

2．5 HO-1活性改变对α-突触核蛋白处理的VM神经元和星形胶质细胞ΔΨm的影响

2．6 激活HO-1对VM神经元内源性α-突触核蛋白表达水平的影响

讨论

结论

参考文献

综述

缩略词表

攻读学位期间的研究成果

致谢

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