Netrin-1对早期糖尿病视网膜病变大鼠视网膜血管通透性的影响

摘要

目的:观察外源性netrin-1对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜血管通透性的影响并分析可能的作用机制。
　　方法:健康清洁级雄性SD大鼠100只，随机分为正常对照组10只，正常+BSS空白对照组10只，糖尿病(DM)组80只。其中，DM组大鼠腹腔注射链脲左菌素(STZ)60mg/kg诱导。常规饲养3个月，每月随机处死DM大鼠3只，行双眼视网膜HE染色，当确定大鼠视网膜出现糖尿病视网膜病变(DR)时将剩余DM大鼠玻璃体腔注射5μl不同浓度netrin-1，并根据浓度不同分为DR+netrin-1低剂量组(10μg/ml)，DR+netrin-1中剂量组(50μg/ml)，DR+netrin-1高剂量组(100μg/ml)及DR+BSS对照组，注药1月后处死全部大鼠。伊文思蓝检测各组大鼠血-视网膜屏障，评估视网膜血管通透性变化;免疫组化方法观察视网膜胶质细胞特异性标记物GFAP的表达情况;荧光定量RT-PCR分析各组视网膜紧密连接蛋白occludin mRNA的表达。
　　结果:正常对照组大鼠视网膜GFAP免疫组化见神经节细胞层及神经纤维层少量棕黄色颗粒，色淡;而在DR空白对照组中原有的视网膜神经纤维层、神经节细胞层棕黄色颗粒颜色加深，染色范围扩大;玻璃体腔注射netrin-1，GFAP阳性染色颗粒范围变小进一步减小，颜色变淡。对GFAP行半定量分析发现:DR+netrin-1注射组较DR空白对照组GFAP表达减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，且netrin-1浓度越高，GFAP阳性表达越低，两者呈明显相关性(P＜0.05)。netrin-1低剂量组与DR空白对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。netrin-1高剂量组与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。对视网膜血管通透性检测显示:DR空白对照组较正常大鼠血管通透性升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，外源性netrin-1可降低视网膜血管的渗透性，但不能使其恢复正常，并且该作用与netrin-1浓度有关(P＜0.05)。荧光定量RT-PCR显示:与正常空白对照组比较，DR空白对照组大鼠视网膜occludin mRNA的表达量减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，外源性给予netrin-1后，occludin mRNA的表达升高，与同病程DR空白对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，虽然occludinmRNA表达增多，但仍不能恢复至正常水平(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.大鼠腹腔注射链脲左菌素3个月时可诱导出糖尿病视网膜病变动物模型。
　　2.糖尿病视网膜病变大鼠血-视网膜屏障通透性增高，紧密连接蛋白occludin与血管通透性密切相关;
　　3.糖尿病视网膜病变时胶质细胞活化增多，其活化状态可影响occludin蛋白的表达，进而调控血管通透性;
　　4.外源性netrin-1对血-视网膜屏障具有保护作用，并且该作用与其浓度有关，浓度越高对视网膜血管的保护作用越显著，但不能逆转糖尿病视网膜病变进程;
　　5.Netrin-1可能是通过抑制胶质细胞活化来调节紧密连接蛋白occludin的表达进而降低血管通透性的。