染料木黄酮抑制人巨细胞病毒即刻早期蛋白表达的实验研究

摘要

目的：
　　1．探究人巨细胞病毒（Human Cytomegalovirous，HCMV）感染人星形胶质细胞(Astrocytes，AS)即刻早期蛋白IE72表达变化。
　　2．通过检测染料木黄酮（Genistein，Gen）抑制HCMV感染AS引起的即刻早期蛋白IE72及其mRNA的表达变化，以此探讨Gen对HCMV感染AS的影响。再检测IE72基因启动子区域(major immediate early promoter,MIEP）组蛋白乙酰化水平，进一步探讨Genistein抑制人星形胶质细胞HCMV感染的分子生物学机制。
　　方法：
　　1．纯化新取材的原代AS，免疫荧光技术（Immunofluorescencetechnique）标记星形胶质细胞的标志性蛋白—胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)。
　　2.MTT检测实验组和对照组细胞活性。
　　3.分别用Real-time PCR和Western blot检测IE72mRNA和蛋白的表达情况，实验分为HCMV组、Gen组、用含40μM Gen的2％ DMEM/F12培养液预处理细胞4h后，以MIO=5的HCMV感染AS组（Gen+HCMV组）、细胞培养至基本融合后更换含2%FBS的D/F12维持培养，以MIO=5的HCMV感染AS，置恒温培养箱中孵育4 h后弃去培养液，更换含40μM Gen的2% DMEM/F12培养液组（HCMV+Gen组）和对照组。
　　4.染色质免疫共沉淀法（ChIP）检测HCMV组、Gen+HCMV组、HCMV+Gen组和对照组的主要即刻早期基因启动子区域（MIEP）组蛋白H3乙酰化水平。
　　结果：
　　1.Cy3标记的抗GFAP显示95%以上细胞为AS。
　　2.MTT显示:40μM Gen+HCMV组24 h、48 h、72 h的吸光值显著高于HCMV组（P<0.05）；病毒形态感染48h后，HCMV组细胞有明显的细胞病变效应（CPE），40μMGen+HCMV组细胞状态良好。
　　3.RT-qPCR结果显示:感染24h、48h、72 h和96h时HCMV+Gen组及Gen+HCMV组IE72的mRNA表达明显低于HCMV组（P<0.05）。
　　4.Western blot结果显示:感染HCMV+Gen组及Gen+HCMV组细胞的IE72蛋白表达都明显低于HCMV组（P<0.05）。
　　5.ChIP法提取MIEP组蛋白H3乙酰化的结果显示:Gen+HCMV组和HCMV+Gen组的水平明显低于HCMV组。
　　结论：
　　1.HCMV能够感染原代星形胶质细胞，是其容许细胞。
　　2.适当浓度的Gen能抑制HCMV感染AS后IE72基因和蛋白表达。
　　3.Gen抑制HCMV IE72基因和蛋白表达可能是通过Gen抑制MIEP组蛋白H3乙酰化来实现的。

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引言

第一章 实验材料

1.1材料

1.2主要试剂的配制

第二章 实验方法

2．1细胞培养

2.2 HCMV AD169株毒种的制备和定量

2.3 MTT比色法检测染料木黄酮对AS细胞增殖作用的影响

2.4 RT-qPCR检测HCMV IE72 mRNA水平表达的变化

2.5蛋白提取与Western blot

2.6 ChIP实验步骤检测IE启动子区域（MIEP）组蛋白乙酰化水平

第三章 结果

3.1 原代人星形胶质细胞的取材、纯化及鉴定

3.2人胚肺成纤维细胞的培养

3.3 HCMV AD169毒株的扩增和定量

3.4各组细胞感染HCMV 24和48h的形态学观察结果

3.5 MTT比色法检测染料木黄酮对AS细胞增殖作用的影响

3.6 HCMV组、HCMV+Gen组和Gen+HCMV组细胞感染HCMV IE mRNA水平的相对表达量

3.7各组细胞感染HCMV 1、2、3和4 d时Western blot检测IE蛋白的变化

3.8 ChIP法MIEP乙酰化检测结果

第四章 讨论

参考文献

综述: 染料木黄酮与HCMV感染

致谢

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