转运siRNA的双靶向长循环多功能信封式纳米基因载体的研究

摘要

本课题制备了一种转运 siRNA的非病毒双靶向长循环多功能信封式纳米装置（Multifunction Envelop-type Nano Device，MEND）。MEND为复合纳米脂质体，同时具有脂质体和纳米粒的特性，通过对其脂质成分进行修饰，达到长循环和肝癌细胞双重靶向的目的，转染效率提高。修饰后的脂质分子结构为：甘草次酸（Glycyrrhetinic，GA）-聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）-肽（Peptide，Pp,基质金属蛋白酶MMP的底物）-二油酰磷脂酰乙醇胺（1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DOPE）。各成分通过酰胺反应结合，核磁共振氢谱法和质谱法进行结构鉴定；PLL压缩的siRNA溶液水化脂质体薄膜后，得到siRNA-MEND。依次利用透射电镜、动态光散射法和超滤离心法，检测 siRNA-MEND的形态、粒径电位以及包封率；体外酶解实验考察siRNA-MEND在血浆中的稳定性；采用MTT法和荧光标记法，考察siRNA-MEND对肝癌BEL-7402细胞生长抑制和转染效率；利用K-Ras-siRNA-MEND对BEL-7402细胞转染，考察细胞侵袭转移和基因沉默。结果表明修饰物GA-PEG-Pp-DOPE成功合成；siRNA-MEND粒子呈光滑的球形，具有明显的脂质双分子层和指纹结构，其粒径分布范围为163.5±20.0nm，平均电位为0.614±0.05mV；MEND对siRNA的包封率为82.8％。酶解实验表明MEND可以保护siRNA免受血浆降解长达120h，是裸siRNA的40倍；修饰成分中的肽可以被MMP-2特异性降解。MEND的细胞毒性小，在MEND转染下细胞的生长平均生长率为87.03±4.65%，siRNA-MEND可以高效率的转染进入细胞质。由K-Ras-siRNA-MEND转染的细胞，其侵袭转移能力明显下降，K-Ras蛋白的表达水平比未转染细胞降低78.61倍。MEND的制备工艺简单，对siRNA具有较强的保护作用，可以明显延长siRNA在血液循环中的时间，转染效率较高。

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引言

第一章 MEND的制备

一、材料与仪器

1.实验材料

2.实验仪器

二、方法和结果

1.修饰性物质GA-PEG-Pp-DOPE的制备

2. SiRNA和多聚左旋赖氨酸（Poly-L-lysine, PLL）的缩合

3. 包载siRNA的多功能信封式纳米载体（siRNA-MEND）的制备

三、讨论

第二章 MEND的制备工艺优化及理化性质研究

一、材料与仪器

1.实验材料

2.实验仪器

二、实验方法和结果

1.MEND制备条件优化

2.形态检测

3.粒径和电位检测

4.包封率

5.血清稳定性考察

6. MMP-2降解作用

三、讨论

第三章 SiRNA-MEND体外活性考察

一、材料与仪器

1. 细胞

2. 实验材料

3.实验仪器

二、实验方法和结果

1. BEL-7402细胞的培养

2. 细胞毒性实验

3. 体外转染研究

4. 细胞侵袭迁移能力考察

5. 基因沉默

三、讨论

全 文 结 论

参考文献

综述:小分子干扰RNA药物载体研究

攻读学位期间的研究成果

致谢

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