联合转运siRNA与EPI的pH敏感长循环逆转多药耐药纳米载体的研究

摘要

在肿瘤治疗中，内源性或获得性的多药耐药是化疗过程中的主要障碍，其降低药物在细胞内的积累或增强肿瘤细胞DNA损伤修复机制，导致单种药物治疗肿瘤的效率降低。基因药物可以抑制细胞多药耐药的发生，但是递送过程面临较多困难，因此选择合适的载体，将基因与化疗药物联合共递送至肿瘤组织，以发挥药效，是治疗肿瘤的一个新策略。本课题制备了一种联合转运siRNA与表阿霉素（EPI）的pH敏感长循环逆转多药耐药多功能信封式纳米载体（Multifunction Envelop-type Nano Device，MEND）。MEND是以压缩的DNA、siRNA等为核心，用含有功能性配体的脂质体包裹而成的类似信封式外壳的纳米微球，兼具了纳米粒和脂质体的优点。选用聚乙二醇（PEG）连接至磷脂分子二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（DSPE）上形成的共聚物DSPE-PEG，实现长循环的目的。通过迈克尔加成反应，合成具有酸敏感性能的含缩酮键的聚β氨基酯结构（KPAE），其通过正负电结合作用，缩合siRNA；在细胞酸性环境中，KPAE的缩酮建断裂，实现siRNA的智能释放。BCL-2-siRNA通过调低P糖蛋白（P-gp）的表达和促进细胞凋亡，逆转细胞多药耐药的发生，协同表阿霉素起到治疗肿瘤的作用。各成分通过核磁共振、凝胶渗透色谱进行结构鉴定；本实验选用薄膜分散法制备复合物载体，EPI包裹在脂质体薄膜的磷脂双分子层疏水端，KPAE/siRNA缩合物溶液水化脂质体薄膜后，得到EPI/siRNA-MEND。利用透射电镜观察其形态；马尔文激光粒度仪测定其粒径及电位；琼脂糖凝胶电泳实验考察复合物对的siRNA缩合能力；分别采用滤膜法-高效液相色谱法和超滤离心法，测定EPI和siRNA的包封率；实验细胞选用人肝癌HepG2细胞，选用BCL-2-siRNA（siBCL-2）制备EPI/siBCL-2-MEND，采用MTT法，考察EPI/siBCL-2-MEND对肝癌HepG2细胞存活率的影响；采用荧光标记法，分别用FAM标记siRNA，LysoTracker-Blue DND-22标记溶酶体，Hoechst33342标记细胞核，考察EPI/FAM-siRNA-MEND在肝癌HepG2细胞的分布以及溶酶体逃逸现象；采用流式细胞法，考察EPI/FAM-siRNA-MEND对肝癌HepG2细胞的转染效率；用EPI/siBCL-2-MEND，对HepG2细胞转染，考察P-糖蛋白（P-gp）的表达。采用小动物活体成像技术，考察EPI/Cy5-siRNA-MEND的体内分布。结果表明，成功合成了所需的各目标产物；MEND呈规则的球形且具有明显的脂质双分子层结构和指纹结构；EPI/siRNA-MEND平均粒径为121.6 nm，平均电位为+41.5 mV；载体复合物对EPI和siRNA的包封率分别为86.13%和97.07%；MEND在一定给药剂量范围内毒性较小，对细胞存活率几乎无影响；EPI/siBCL-2-MEND高于同浓度下单独药物的肿瘤细胞抑制率，并具有较高的转染效率；相比于游离的EPI组和EPI-MEND组，EPI/siBCL-2-MEND 可显著下调 P-gp的表达；EPI/Cy5-siRNA-MEND相比单独药物更容易富集于肝脏中，肾脏内几乎无分布，证明其具有长循环性能。所制备的载体复合物能够有效地将siRNA与EPI共递送至肿瘤细胞中，实现高效率的转染，并实现siRNA在细胞内的智能释放，具有良好的使用前景。

目录

引言

第一部分 载体材料的制备及表征

材料与方法

结果

讨论

第二部分 载体复合物的制备及表征

材料与方法

结果

讨论

第三部分 EPI/siBCL-2-MEND体内外活性研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述：基因药物与化疗药物共递送治疗肿瘤的研究进展

攻读学位期间的研究成果

缩略词表

致谢

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