狭鳕鱼皮胶原蛋白肽防治地塞米松致大鼠骨质疏松作用研究

摘要

目的：复制地塞米松致大鼠骨质疏松模型和成骨细胞损伤模型，研究狭鳕鱼皮胶原肽对骨质疏松的预防和治疗作用。建立高效液相色谱法同时检测Pro-Hyp和 Gly-Pro-Hyp的方法，确认小分子肽的生物活性。
　　方法:动物实验：将100只8周龄wistar雄性大鼠随机分为5组，预防给药组（造模4周前给药胶原蛋白肽1g/kg/d，连续给药23周）治疗组（造模6周后给药胶原蛋白肽0.5g、1g/kg/d，连续用药13周）地塞米松损伤组，正常对照组；除正常对照组外，其余各组在大鼠12周龄时，每周2次臀肌注射地塞米松磷酸钠注射液1.0 mg/kg，对大鼠股骨X光经时摄片（10、16、23周），经腹主动脉取血，ELISA法同期检测BALP、PINP、CTX-1、TRAP含量，HE染色经时测量骨小梁面积的百分比和骨皮质厚度，免疫组织化学法检测TGF-β的表达。高效液相色谱方法为：色谱柱venusic ASB-C18(250mm×4.6mm，5um)，柱温：40℃；流动相：乙腈和纯水梯度洗脱；流速：1.0ml/min；检测波长：220nm。细胞实验：建立并鉴定大鼠颅骨源成骨细胞，复制地塞米松损伤模型，实验设计：正常组、地塞米松损伤组、胶原蛋白肽（100、200和400 ug/ml）组、三肽（200 ug/ml）组、RU486地塞米松拮抗剂组，采用CCK-8法检测各组细胞的存活率；Western blotting法检测骨钙蛋白（OCN）的表达。
　　结果：动物实验：成功复制了地塞米松致大鼠骨质疏松模型，经X光片灰度值分析，模型组（64.49±2.71）较正常组（109.23±1.48）显著降低（P<0.01）,并持续稳定至实验期末，胶原蛋白肽预防组（连续给药10周）灰度值较同期模型组升高，且随给药时间延长递增，两个剂量治疗组（连续给药6周）灰度值均升高，给药13周时分别升至76和84左右（P<0.01），大剂量治疗效果好于小剂量组。骨关节HE染色结果表明，模型组骨小梁数量减少，其面积百分比较正常组下降50％，且连接间隙较大，空腔面积亦扩大，还可见部分骨皮质断裂，骨皮质厚度呈现不同程度的变薄。预防组连续给药16周时，骨组织学观察指标改善，骨小梁面积百分比由47%升至56%，较模型组35%差异具有统计学意义（P<0.01），且随增时骨病理组织学指标进一步好转。大小剂量治疗组对骨形态指标的影响均较同期模型组升高，也呈时间依赖性，以大剂量组治疗效果为佳。免疫组织化学经时检测TGF-β平均积分光密度发现，模型组较正常组降低，差异具有显著性，胶原蛋白肽预防给药10周大鼠TGF-β1平均积分光密度值升高，并呈经时性升高，成模后经大小剂量治疗6周该光密度积分值开始升高，也呈经时性增加（P<0.05）。ELISA结果显示，模型组血清骨形成指标BALP、PINP的含量较正常组显著降低（p<0.01），胶原蛋白肽各给药组均较模型组呈时间依赖性升高（p<0.05），模型组血清骨吸收 CTX-1、TRAP较正常组的含量升高，胶原蛋白肽防治各组均较模型组经时性降低（p<0.05）。高效液相色谱法：检测 Pro-Hyp的浓度在0.005 mg/ml～0.5 mg/ml（R2=0.9999）、Gly-Pro-Hyp的浓度在0.01 mg/ml～1 mg/ml（R2=0.9998），线性关系良好；Pro-Hyp（低、中、高浓度）的平均回收率分别为99.26%、98.77和99.07，RSD分别为1.71,2.63和2.33；Gly-Pro-Hyp（低、中、高浓度）的平均回收率分别为98.89%,98.22%和99.57%，RSD分别为1.70，1.20和0.84。表明Pro-Hyp和Gly-Pro-Hyp的加样回收率良好。正常组Pro-Hyp、Gly-Pro-Hyp含量分别为0.096、0.079（mg/ml），模型组血清小分子肽含量明显降低，分别为0.029、0.044（mg/ml），预防给药组小分子肽含量较模型组显著升高，为0.148、0.107（p<0.01）。细胞实验：经10-5mol/L地塞米松损伤48h后成功复制成骨细胞损伤模型，狭鳕鱼皮胶原蛋白肽三个剂量能提高成骨细胞存活率为70%，但组间无显著差异（P>0.05），三肽组作用高达139%(P<0.01）。Western Blot检测到胶原蛋白肽和三肽组骨钙蛋白表达量也较模型组显著升高，以三肽组作用最为显著。
　　结论：狭鳕鱼皮胶原蛋白肽在实验剂量下能呈时间依赖性防治大鼠地塞米松性骨质疏松；大鼠血清 Gly-Pro-Hyp和Pro-Hyp的含量与骨质疏松呈负相关，胶原蛋白肽抗骨质疏松作用可能与在小分子活性小肽有关；狭鳕鱼皮胶原蛋白肽和三肽均能直接促进颅骨源成骨细胞的增殖和成熟，其中以三肽效佳。

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引言

第一章 试剂和仪器

1.1实验动物和细胞

1.2实验用品与试剂

1.3实验仪器

第二章 实验方法

2.1大鼠饲养、分组与组织处理

2.2 灌胃狭鳕鱼皮胶原蛋白肽后大鼠血清中 Pro-Hyp 和 Gly-Pro-Hyp含量的测定

2.3颅骨源成骨细胞的提取和鉴定、分组、细胞上清和蛋白提取

2.4统计学分析

第三章 实验结果

3.1动物实验结果

3.2高效液相色谱法血清中Pro-Hyp和Gly-Pro-Hyp样品方法学验证结果

3.3成骨细胞实验结果

第四章 讨论

结论

参考文献

综述: 胶原蛋白肽抗糖皮质激素性骨质疏松的研究进展

攻读学位期间的研究成果

致谢

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