脂蛋白相关磷脂酶A2基因R92H和V279F多态性与缺血性卒中易感性及其亚型的相关性研究

摘要

背景：缺血性卒中的发病原因较多，除了传统的血管危险因素，如高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟、饮酒、肥胖等因素外，遗传因素在脑血管动脉粥样硬化的发生发展中也起到重要的作用，分析人群中遗传因素对脑卒中的作用对于开展卒中早期预防，指导脑卒中的治疗等具有重要作用。近年来的研究已经发现，炎症及氧化应激在动脉粥样硬化性疾病的发生、发展中起到重要的作用。血管内皮细胞受到损伤性刺激，如吸烟、高血压、高血糖、高血脂等后可以发生质的变化，被称为“内皮活化”，这是动脉粥样硬化性疾病最早发生的事件。活化后的内皮分泌粘附分子及趋化因子，导致内皮对大分子的渗透性增加，从而出现内皮下细胞外基质的结构变化。因此，低密度脂蛋白（LDL），特别是那些较小较密集的LDL，具有更强的促动脉硬化作用，深入血管内皮，聚集在内膜下，并在那里发生氧化。氧化后的LDL导致血管内单核细胞聚集并促进其转化为巨噬细胞。后者吞噬氧化后的LDL并转化为泡沫细胞，这也是动脉硬化斑块的最本质成分。动脉粥样硬化发展到一定程度可导致临床症状出现，如导致动脉管腔狭窄出现器官供血、供氧不足表现为心绞痛发作、短暂性脑缺血发作、间歇性陂行等，或者不稳定斑块破裂、出血并出现局部血栓形成，出现急性心肌梗死、脑梗塞等。许多研究发现，与缺血性心脑血管病密切相关的动脉粥样硬化血栓并不与动脉斑块导致的血管狭窄程度完全一致，而更主要是与斑块的性质有关，更具体的讲，是与局部的炎症程度，斑块纤维冒的厚薄，斑块降解相关的炎症细胞因子、金属蛋白酶等相关。这可以解释为什么许多动脉斑块程度较轻的患者出现了严重的动脉缺血性事件。发现对预测缺血性脑血管病有价值的循环标记物是目前脑血管疾病研究的热点之一。C反应蛋白、胆固醇水平等既往研究的标记物对缺血性脑血管病的预测价值较小，寻找动脉斑块稳定性有预测价值的新型循环标记物在临床研究中非常必要。脂蛋白相关磷脂酶 A2（lipoprotein-associated phospholipaseA2，Lp-PLA2），是磷脂酶A2蛋白家族中的一员，在氧化型LDL等促炎磷脂酶及促动脉粥样硬化性代谢产物如溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine）及氧化型脂肪酸（oxidized free fattyacids）的产生中发挥了重要作用。对Lp-PLA2基因多态性的研究，目前发现位于9号外显子的V279F位点与日本人冠心病及脑卒中的发病相关，位于位于11号外显子上的A379V多态性位点与韩国冠心病及中国缺血性卒中的发病相关，但目前尚没有关于位于4号外显子上的R92H位点及V279F位点与中国缺血性脑卒中发病危险性的研究。因此本研究主要对R92H及V279F位点与中国大陆地区缺血性脑卒中及不同亚型的发病风险进行了相关研究。
　　目的：①对缺血性脑卒中患者与正常对照人群脂蛋白相关磷脂酶 A2（Lp-PLA2）基因 R92H和 V279F两个多态性位点的分布特点进行研究，并比较缺血性卒中患者与正常对照者两个位点基因型和基因频率的分布差异；②对Lp-PLA2基因多态性R92H和V279F两个位点与中国汉族人群缺血性脑卒中患者血管危险因素、脑卒中TOAST分型、血脂分析、预后之间的关系进行分析，并对Lp-PLA2在缺血性脑卒中的发病、发展中的作用进行评价。
　　方法：⑴收集经颅脑MR或CT证实的缺血性脑卒中患者及正常对照者，收集缺血性脑卒中传统血管危险因素，如年龄、性别、家族史、高血压、糖尿病、高血脂、吸烟、饮酒病史。⑵空腹抽取前臂静脉血，应用血液基因组 DNA提取试剂盒提取白细胞DNA。⑶应用PCR及基因直接测序法测定Lp-PLA2基因R92H和V279F两个位点的多态性，并对两个位点的基因型和等位基因频率在缺血性卒中组及对照粗中的分布进行比较。⑷对两个基因位点多态性与缺血性卒中的发病及预后的关系进行分析。
　　结果：①共有386名缺血性卒中患者纳入本次研究，经TOAST分型后分为LAA组254例与SAO组132例，LAA组平均年龄62.1±9.89岁，男性68.9％，SAO组平均年龄24.8±2.64岁，男性69.7%。对照组386例，平均年龄61.9±9.84岁，IS传统危险因素如高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟、饮酒、既往TIA病史等在IS组明显高于对照组。②缺血性脑卒中（IS）组血清Lp-PLA2水平明显高于对照组，有显著性差异（P<0.01）；LAA组、SAO组与对照组比较，血清Lp-PLA2水平均升高，有显著性差异。③缺血性脑卒中组ApoA1、HDL-C平均水平均明显较对照组降低，而空腹血糖（FBG）平均水平明显高于对照组，甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）平均水平在脑卒中组明显低于正常对照组。④R92H位点的GA、GA+AA基因型频率在IS组明显高于对照组，差异有显著性（28.8%，p=0.006；30.8%，P=0.009）。而R92H的A等位基因频率在IS组明显高于对照组，差异有显著性（16.5%，P=0.001）。V279F中的显性模型VF+FF基因型在IS组表达频率明显高于对照组，差异具有显著性（30.0%，p=0.007）。VF基因型在IS组表现率较高（28.0%，P=0.004）。而V279F中的F等位基因频率在IS组明显高于对照组（15.8%，P=0.002）。⑤R92H位点的GA+AA基因型、GA基因型与LAA型IS明显相关，而SAO型脑卒中与各基因型关联性不明显，V279F位点的VF+FF基因型及VF基因型与LAA性卒中显著相关（2=10.837，p=0.003；?2=9.366，p=0.006），而SAO性卒中与各基因型及等位基因频率无显著相关性（P>0.05）。⑥Logistic回归分析发现，R92H位点GA、AA+GA基因型及A等位基因与IS相关性高（三者分别为OR=1.43，95%CI=1.03-1.98，p=0.032；OR=1.47，95%CI=1.07-2.02，p=0.027；OR=1.42，95%CI=1.07-1.89，p=0.024），V279F中的VF+FF基因型及 F等位基因与 IS显著相关（两者分别为OR=1.42,95%CI=1.03-2.04,p=0.028；OR=1.42,95%CI=1.07-2.24,p=0.031）。7.Cox回归分析显示R92H基因型与IS患者复发相关。其中GA+AA基因型与IS复发关联性强（OR=1.75,95%CI=1.03-2.29，P=0.041），V279F基因型与 IS患者复发相关。其中 VF+FF基因型与 IS复发关联性强（OR=1.72,95%CI=1.01-2.35，P=0.039）。
　　结论：⑴血清Lp-PLA2水平与缺血性卒中发病密切相关，缺血性卒中组Lp-PLA2水平明显高于正常对照组。⑵Lp-PLA2基因R92H位点多态性与中国汉族缺血性卒中发病密切相关，GG+GA基因型，GA基因型和A等位基因频率在缺血性卒中组明显升高；R92H基因多态性与LAA型脑卒中有较明显的关系，而与SVO分型无明显关系。⑶Lp-PLA2基因V279F位点的FF+VF基因型，VF基因型和F等位基因频率均与中国汉族人群缺血性卒中的发病相关，V279F基因多态性与 L AA型脑卒中有较明显的关系，而与SVO分型无明显关系。⑷R92H和V279F位点与缺血性卒中复发相关，与LAA性卒中关系更为密切。

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引言

实验对象与材料

1、临床实验对象

3、主要试剂

3、引物设计

4、主要仪器设备

5、主要试剂配制

第一部分 缺血性卒中患者危险因素评估

1、临床基线资料的收集

2.危险因素评估标准

3.统计学方法

4.实验结果

第二部分脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）与缺血性卒中的关系

1.实 验 方 法

2.Lp-PLA2第4号外显子R92H和第9号外显子V279F基因直接测序法基因多态性分析

3.随访

4.统计学分析

5.实 验 结 果

讨论

（一）、单核苷酸多态性与DNA直接测序法分型

（二）Lp-PLA2基因位点R92H和V279F多态性与缺血性卒中及其亚型的关系

结论

参考文献

综述: 脂蛋白相关磷脂酶 A2在动脉粥样硬化中的应用新进展

攻读学位期间研究成果

致谢

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