淫羊藿苷及淫羊藿素通过GPER和IGF-1R抑制小胶质细胞炎症反应保护多巴胺能神经元的实验研究

摘要

帕金森病（Parkinson's Disease，PD）以黑质致密带（substantia nigra par compacta, SNpc）多巴胺能神经元的进行性变性、缺失为主要病变。越来越多的研究证明神经炎症在PD的发病中起着重要作用。小胶质细胞是中枢神经系统（central nervous system，CNS）内的重要免疫感受效应细胞，研究指出多巴胺能神经元易受炎症侵袭的影响，PD患者的PET影像结果显示小胶质细胞的活化与多巴胺能神经元的丧失平行发生，提示炎症反应和PD的发病密切相关。因此通过药物的抗炎作用，保护中脑黑质多巴胺能神经元，延缓PD的进展，成为PD治疗的新策略。
　　淫羊藿苷（icariin，ICA）是从淫羊藿中分离提取的黄酮类化合物，是淫羊藿的主要活性成分。研究显示，口服ICA后，经消化道内肠道菌群的水解反应，可生成淫羊藿素（icaritin，ICT）。文献报道，ICA有神经保护作用，能够改善老年大鼠的认知障碍，激活海马静止状态的神经干细胞。ICA可以抑制原代培养下丘脑神经元的凋亡。此外，ICA具有明显的抗炎作用。Zeng KW等报道，ICA能通过抑制 TAK1/IKK/NF-κB和JNK/p38 MAPK信号途径，对抗脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）对原代培养的皮层小胶质细胞的激活作用。但在帕金森病炎症模型，ICA是否能够对抗炎性因子对中脑黑质多巴胺能神经元的损伤及其详细的抗炎机制，目前研究较少。近年来的研究显示，ICT作为ICA的水解衍生物，属于植物雌激素，具有类雌激素样作用，能发挥雌激素样的神经保护作用和抗炎作用。但ICA和ICT是通过何种细胞膜靶蛋白发挥其抗炎作用，目前仍然不明确。G蛋白偶联雌激素受体（G protein-coupled estrogen receptor，GPER）是7次跨膜G蛋白偶联受体家族中的一员。研究表明，雌激素的抗炎和神经保护作用与GPER介导的快速非基因组效应密切相关。雌激素与GPER结合后，通过G蛋白，激活腺苷酸环化酶、磷脂酶C及生长因子受体等信号途径，快速调控细胞的功能活动，发挥其生物学作用。研究报道，在黑质和纹状体 GPER广泛表达，而且雌激素对多巴胺能神经元的保护作用与GPER关系密切。Ma HR等报道，ICA、ICT可通过GPER、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）介导的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路刺激乳腺癌细胞SKBr3细胞的增生。我们课题组前期的工作证实ICT可通过胰岛素样生长因子-1受体（insulin-like growth factor-I receptor，IGF-1R）信号途径对抗神经毒素1-甲基-4苯基-吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridinium ion，MPP+）对多巴胺能神经元MES23.5细胞的损伤。应用神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）制备的PD小鼠模型，证明ICA能够对抗神经毒素MPTP对黑质多巴胺能神经元的损伤，其作用机制可能与MEK/ERK与PI3K/Akt信号通路的激活有关。鉴于以上研究背景，我们提出ICA、ICT是否通过GPER与IGF-1R介导的信号途径发挥抗炎的神经保护作用？我们研究的第一部分通过LPS作用于BV2小胶质细胞建立炎症模型，从离体细胞水平探讨GPER和IGF-1R在ICA、ICT抗炎机制中所发挥的作用。第二部分通过黑质内单侧注射LPS建立去卵巢大鼠PD炎症模型，从整体水平进一步探讨ICA能否通过GPER和IGF-1R抑制小胶质细胞的炎症反应从而保护DA能神经元。
　　1.淫羊藿苷（ICA）及淫羊藿素（ICT）通过GPER和IGF-1R抑制BV2小胶质细胞炎症反应的实验研究
　　LPS建立BV2小胶质细胞炎症模型，应用GPER阻断剂G15或IGF-1R阻断剂JB-1与ICA或ICT共同处理细胞，采用实时荧光定量PCR和免疫印迹技术，探究ICA和ICT通过GPER和IGF-1R发挥抗炎作用的机制。结果如下：
　　（1）LPS组炎性因子TNF-α、IL-1β、COX-2和iNOS的mRNA表达水平明显升高（P＜0.05）。不同浓度的ICA（1,10,20,50μM）、ICT（1,10,20,50μM）预保护，能不同程度地抑制以上炎性因子的基因表达，其中10μM和20μM的ICA和ICT作用最明显（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），在后续实验中，我们选用10μM的ICA和ICT。
　　（2）GPER阻断剂G15能阻断ICA、ICT在基因水平对LPS诱导的炎性因子TNF-α、IL-1β、COX-2和iNOS表达的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01）。
　　（3） IGF-1R阻断剂JB-1亦能阻断ICA、ICT在基因水平对LPS诱导的抑制炎性因子TNF-α、IL-1β、COX-2和iNOS表达的作用（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。
　　（4）ICA及ICT能明显抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞COX-2和iNOS蛋白表达的增加（P＜0.01，P＜0.001），此作用可被G15或JB-1所阻断（P＜0.05，P＜0.001）。
　　（5）LPS组MAPKs蛋白（ERK、p38、JNK）的磷酸化水平明显增加（P＜0.05，P＜0.01）；ICA、ICT能不同程度地抑制LPS诱导的MAPKs蛋白的磷酸化水平（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；G15或JB-1可阻断ICA、ICT的保护作用（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。
　　（6）LPS组IκB蛋白的磷酸化水平亦明显增加（P＜0.05，P＜0.01）； ICA、ICT能明显抑制LPS诱导的IκB蛋白的磷酸化水平（P＜0.01，P＜0.001）；此保护作用可被G15或JB-1所阻断（P＜0.01）。
　　上述结果提示，ICA、ICT能够通过GPER和IGF-1R介导的信号通路抑制BV2小胶质细胞的炎症反应。
　　2.淫羊藿苷（ICA）通过GPER和IGF-1R抑制大鼠小胶质细胞炎症反应保护黑质多巴胺能神经元的机制研究
　　采用黑质内单侧注射LPS建立去卵巢大鼠PD炎症模型，灌胃给予ICA（10mg/kg），通过腹腔注射阿扑吗啡（apomorphine，APO）诱导大鼠的旋转行为。采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）、实时PCR、免疫印记等多种评价方法，系统探讨了ICA通过抑制炎症反应保护多巴胺能神经元的分子机制。结果如下：
　　（1）旋转行为：LPS炎症模型组，APO诱导的大鼠旋转圈数较对照组明显增加（P＜0.001）；ICA（10 mg/kg）给药保护组的旋转圈数与LPS组相比明显减少（P＜0.001），此作用可被GPER阻断剂G15或IGF-1R阻断剂JB-1所阻断（P＜0.001）。ICA单用组大鼠无明显的旋转行为。
　　（2）HPLC结果显示，损伤侧LPS组纹状体（striatum，Str）内的多巴胺（dopamine，DA）及其代谢产物高香草酸（homovanillic acid，HVA）、二羟基苯乙酸（dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC）含量比对照组含量明显减少（P＜0.001）；ICA给药组大鼠损伤侧Str内的DA、DOPAC和HVA均明显增高，与LPS组相比具有显著差异（P＜0.05，P＜0.01），G15或JB-1可阻断此作用（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。ICA单用组DA、DOPAC和HVA的含量与对照组没有差异。
　　（3）单侧黑质注射LPS导致损伤侧黑质内TH免疫阳性神经元数目较未损伤侧明显减少，存活率只有未损伤侧的37%；损伤侧TH蛋白的表达也较对照组明显减少（P＜0.01，P＜0.001）；ICA给药组大鼠损伤侧 TH阳性神经元数目及 TH蛋白的表达均明显高于LPS组损伤侧（P＜0.05，P＜0.01），TH阳性神经元存活率均超过60%，此作用可被G15或JB-1阻断（P＜0.05，P＜0.01）。ICA单用组TH免疫阳性神经元数目和TH蛋白表达与对照组没有差异。
　　（4）免疫组化结果显示LPS组损伤侧黑质内小胶质细胞呈现过度激活态，并且数目明显增多；给予ICA保护后，能明显抑制损伤侧黑质内活化的小胶质细胞的数目及激活程度，此作用可被G15或JB-1阻断。ICA单用组小胶质细胞没有明显的激活。
　　（5）实时荧光定量PCR结果显示，LPS组黑质内IL-1β、TNF-α和iNOS mRNA的表达水平明显高于对照组（P＜0.001）；而ICA给药组炎性因子的mRNA表达水平则明显降低（P＜0.01，P＜0.001）；上述ICA的保护作用可以被G15或JB-1所阻断（P＜0.05，P＜0.01）。ICA单用组黑质内IL-1β、TNF-α和iNOS mRNA表达与对照组没有差异。（6）LPS组黑质内的COX-2和iNOS蛋白表达水平明显高于对照组（P＜0.01）；ICA能明显抑制LPS组COX-2和iNOS蛋白表达的增加（P＜0.05，P＜0.001），此作用可被GPER阻断剂G15或IGF-1R阻断剂JB-1所阻断（P＜0.05，P＜0.01）。ICA单用组黑质内COX-2和iNOS蛋白表达与对照组没有差异。
　　（7）LPS组损伤侧黑质内ERK、P38及JNK的磷酸化水平明显高于对照组（P＜0.05，P＜0.01）；而ICA+LPS组上述蛋白的磷酸化水平则被明显抑制（P＜0.05，P＜0.01），此作用可被G15或JB-1所阻断（P＜0.05）。
　　（8）LPS组损伤侧黑质内 IGF-1R表达明显低于对照组（P＜0.01）；而 ICA+LPS组IGF-1R的表达与LPS组相比明显上调（P＜0.01），G15或JB-1可阻断ICA的保护作用（P＜0.05）。
　　以上结果提示，ICA可通过GPER、IGF-1R信号途径抑制小胶质细胞的炎症反应，减轻其对黑质DA能神经元的损伤。
　　结论：在离体细胞水平，ICA、ICT能够对抗LPS诱导的BV2小胶质细胞的炎症反应。在整体动物水平，ICA能够抑制LPS导致的PD炎症大鼠黑质小胶质细胞的过度激活从而保护DA能神经元。GPER、IGF-1R信号途径参与了ICA、ICT的抗炎神经保护作用。本研究为PD的治疗提供了新的实验依据和靶点。

目录

引言

第一部分 淫羊藿苷及淫羊藿素通过GPER和IGF-1R抑制BV2小胶质细胞炎症反应的实验研究

材料与方法

1 BV2小胶质细胞

2 实验试剂

3实验仪器

4 BV2小胶质细胞培养

5实时荧光定量反转录PCR

6蛋白免疫印迹实验

7 统计学分析

结果

1不同浓度ICA对LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症反应的抑制作用

2不同浓度ICT对LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症反应的抑制作用

3 ICA、ICT抑制LPS诱导的炎性因子mRNA的表达及G15的阻断作用

4 ICA、ICT抑制LPS诱导的炎性因子mRNA的表达及JB-1的阻断作用

5 ICA、ICT抑制炎性蛋白COX-2、iNOS的表达及G15、JB-1的阻断作用

6 ICA、ICT通过GPER和IGF-1R影响 MAPKs家族蛋白的磷酸化水平

7 ICA、ICT通过GPER、IGF-1R抑制LPS诱导的NF-κB的激活及G15、JB-1的阻断作用

第二部分 淫羊藿苷通过GPER和IGF-1R抑制大鼠小胶质细胞炎症反应保护黑质多巴胺能神经元的机制研究

材料与方法

1 实验动物

2 实验试剂

3实验仪器

4 实验分组

5 双侧卵巢切除术（Ovariectomy，OVX）

6 实验动物模型制备及给药

7实验大鼠行为学测试

8高效液相色谱法(HPLC)检测大鼠纹状体内多巴胺及其代谢产物的含量

9免疫组织化学检测大鼠黑质TH阳性细胞数及小胶质细胞CD11b蛋白表达

10免疫印迹实验

11实时荧光定量反转录PCR

12 统计学处理

结果

1 ICA对PD炎症模型大鼠旋转行为的影响及G15、JB-1的阻断作用

2 ICA 对 PD 炎症模型大鼠纹状体内 DA 及其代谢产物含量的影响及G15、JB-1的阻断作用

3 ICA对PD炎症模型大鼠黑质TH阳性神经元的影响及G15、JB-1的阻断作用

4 ICA 通过GPER、IGF-1R抑制LPS诱导的黑质内小胶质细胞的激活

5 ICA对PD炎症模型大鼠黑质内炎性因子TNF-α、IL-1β、iNOS基因表达的影响及G15、JB-1的阻断作用

6 ICA对PD炎症模型大鼠黑质内COX-2、iNOS蛋白表达的影响及G15、JB-1的阻断作用

7 ICA对PD炎症模型大鼠黑质内MAPKs蛋白表达的影响及G15、JB-1的阻断作用

8 ICA对PD炎症模型大鼠黑质内IGF-1R表达的影响及G15、JB-1的阻断作用

讨论

结论

参考文献

综述:炎症反应在帕金森病中的作用及其防治

攻读学位期间发表的论文、参加的会议和参与的课题情况

附录

致谢