脂蛋白脂酶基因突变(C310R/E396V)致家族性高乳糜微粒血症的分子机制研究

摘要

目的：
　　我们在国际上首次发现两个全新的脂蛋白酯酶基因的突变C310R（c.T928C）和E396V（c.A1187T）。本课题拟在人体水平和细胞水平上对该突变基因进行功能性和分子机制研究，有助于构建我国家族性高乳糜微粒血症患者的脂蛋白脂酶基因突变型与表型关系谱。
　　方法：
　　提取先证者全体家族成员的外周血DNA，利用全外显子测序技术确定脂蛋白脂酶突变位点，然后通过一代测序进行验证。体内实验需分别在携带脂蛋白脂酶基因突变的患者和正常人体内注射肝素（60IU/kg），通过酶联免疫吸附法检测肝素后血浆中脂蛋白脂酶浓度，酶荧光法检测脂蛋白脂酶和肝脂酶的活性，非变性胶western blot检测突变对于LPL二聚体形成的影响。体外实验构建携带该突变基因位点的慢病毒表达载体，通过转染COS-1细胞，分别检测细胞上清和裂解液内脂蛋白脂酶的活性和浓度。通过荧光定量聚合酶链式反应检测该突变对于基因转录水平影响。
　　结果：
　　全外显子测序结果显示先证者马建华（I-2）的脂蛋白脂酶基因6号外显子有一个新的T>C的杂合子突变(c.T928C)，该突变导致编码的半胱氨酸转变为精氨酸(p.C310R)；而马超（II-1）则携带两个脂蛋白脂肪酶基因复合杂合子突变，其中一个突变位点与马建华相同，另一个突变位点位于8号外显子A>T的突变（c.A1187T），该突变使编码的谷氨酸转变为缬氨酸(p.E396V)。人体水平的研究发现先证者和 I-1血浆中脂蛋白脂酶的浓度和活性与正常人相比均明显下降，两个突变位点均不影响脂蛋白脂酶正常二聚体化。体外实验结果表明这两种突变均可以造成分泌出胞外的脂蛋白脂酶活性下降，浓度减低。进一步的研究发现，脂蛋白脂酶C310R突变可以影响脂蛋白脂酶基因转录后修饰，使细胞合成的脂蛋白脂酶总量降低；而E396V突变则影响脂蛋白脂酶在细胞内转运。
　　结论：
　　这两个位点的突变均为致病性基因突变，其最终通过减少分泌的脂蛋白脂酶的浓度和活性，影响体内甘油三酯的正常代谢。