磁性前列地尔脂微球靶向治疗大鼠腹部皮瓣缺血再灌注损伤的基础研究

摘要

皮瓣移植技术是整形外科领域的一项重要技术手段，并被广泛应用于骨科、显微外科、口腔颌面外科、眼科等其他专业领域，但是皮瓣移植常常需要经过一定时间的缺血、缺氧期，缺血后血液再灌注时必然会对组织造成一定的损伤，影响皮瓣成活。而皮瓣移植后一旦出现坏死，就必然会给患者带来不可挽回的肉体痛苦、精神伤害和经济损失。皮瓣移植的成活率受多种因素的影响，皮瓣损坏严重、手术操作不当、术后时间过长等都影响皮瓣成活，移植过程中的血管痉挛性收缩是常见原因之一，而游离皮瓣移植后，血管再通血流恢复后所造成的组织缺血再灌注损伤也是影响皮瓣成活的重要因素。目前认为，再灌注时过多的自由基生成导致脂质过氧化造成细胞膜破坏、蛋白质和基因损伤、细胞内钙超载、炎症细胞的大量浸润和组织水肿等导致微循环障碍，最终引起皮瓣损伤。目前针对该领域的研究仍然停留在应用某一种或多种血管活性药物应用以后，对于清除氧自由基、改善膜通透性、抑制钙离子内流，甚至降低炎细胞浸润等方面的作用。而对于某种药物的靶向性皮瓣内聚集，进而发挥更加明显的改善作用，以及靶向治疗与传统的用药方式有何差别，目前尚未有明确研究。 磁流体又称磁性胶体，是指经表面活性剂的包覆或改性后的磁性纳米颗粒，高度均匀地分散到载液中，形成稳定、功能化的胶体溶液，既有固体材料的强磁性又有液体材料的流变性，由外加磁场设定可定位和定向控制其流动和分布，是一种高科技智能纳米材料。近年来，被广泛应用于磁流体热疗、磁栓塞封死治疗、磁性药物靶向治疗、影像学检查、细胞分离等领域。尤其在磁性药物靶向治疗中，磁流体可作为药物的磁性载体粒子，携带特定药物在外加磁场作用下在体内靶向移动、定位蓄积，提高靶部位药物的浓度，减少药物对全身其他正常组织的毒性和不良反应。近几年，国内外先后有学者就磁性药物的靶向治疗进行了一系列的基础实验、动物实验和临床实验，结果表明磁性靶向治疗这种方案是安全的，是有效的。目前该领域的研究主要集中在肿瘤治疗方面，而在整形外科领域，特别是皮瓣研究领域尚无报导。 前列地尔，又称前列腺素E，是一种天然前列腺素(prostaglandin，PG)类物质，是多不饱和脂肪酸二高r-亚油脂酸的氧化产物，具有内源性前列腺素E相类似的性质和特点。内源性前列腺素E是正常生物体内广泛分布的一种前列腺素物质，化学性质比较活泼，多在局部发挥作用后被迅速灭活。前列地尔作为一种高效生物活性的前列腺素物质,有多种生物学作用，不仅可以明显抑制毛细血管平滑肌收缩，减少血小板聚集、抑制血栓烷A2生成，增加红细胞变形能力、减少红细胞聚集,从而改善微循环，同时还能通过作用于血管内皮，减少其分泌内皮素(endothelin,ET)，使其内皮型一氧化氮合酶的活性和表达升高，增加血清一氧化氮(nitrogen monoxide, NO)含量，发挥抑制神经损伤、预防和逆转动脉粥样脂质斑块的形成等多种作用。磁性前列地尔脂微球是将前列地尔、磁流体等包封直径在0.2微米左右的脂微球中，制成的磁性药物，在外加磁场的作用下，可以实现靶向性地将前列地尔运送到病变部位，减少全身其他组织药物浓度，实现靶向性治疗的目的。因此，这种靶向治疗，较传统给药方式，能有效预防药物的全身不良反应，具有目标性强、效率高、持续性好、毒性低等特点。而目前，对于磁性前列地尔脂微球靶向性皮瓣内聚集，进而发挥改善血管痉挛性收缩、降低皮瓣缺血再灌注损伤等作用，提高皮瓣成活率，尚没有报道和研究。 研究目的：制备磁性前列地尔脂微球，建立大鼠腹部皮瓣缺血再灌注损伤模型，检测缺血再灌注前后皮瓣血流量、脂质过氧化物、一氧化氮、血管内皮因子及微血管生成情况。研究磁性前列地尔脂微球靶向治疗对大鼠腹部皮瓣缺血再灌注损伤相关指标及微血管生成的影响，探讨磁性前列地尔脂微球靶向治疗这种新型给药方式对大鼠皮瓣成活率影响，为临床防治皮瓣移植出现的组织缺血再灌注损伤，提高皮瓣移植成活率提供理论依据和新的方法。 研究方法：1.磁性前列地尔脂微球的制备及响应观察:采用乳化热固化技术，将牛血清白蛋白溶于前列地尔蒸馏水溶液中，再加入磁流体，然后与蓖麻油混合并搅拌，再经过超声乳化。再将制备的乳浊液与加热的蓖麻油混合并搅拌，加入乙醚以脱脂，并离心、弃去油相，经沉淀，漂洗，最后置换在蒸馏水中，冷冻干燥，即成磁性脂微球冻干粉末。将磁性前列地尔脂微球按1∶10的浓度比，加入0.1%生理盐水中，经超声分散，置于倒置显微镜下观察磁性脂微球的分散情况。将1滴磁性脂微球溶液滴于载玻片一端，然后将1块铷铁硼磁铁（表面强度为3000高斯）置于载玻片另一端，显微镜下观察磁性脂微球的运动和聚集情况。2.建立大鼠腹部皮瓣缺血再灌注损伤的动物模型:将雌性SD大鼠，进行全身麻醉，根据Manson等的方法设计大鼠腹部岛状皮瓣，在皮下内膜层掀起以腹壁浅血管为蒂的大小为3cmx6cm的岛状皮瓣。腹壁浅血管被微血管夹暂时夹闭以阻断其血流，造成皮瓣缺血，5小时后开放血管使血流再灌注，形成缺血再灌注损伤模型。3.实验分组:30只SD大鼠随机分为：实验组、对照组、空白组3组，每组10只。腹壁浅血管被微血管夹暂时夹闭以阻断其血流，造成皮瓣缺血，5小时后开放血管使血流再灌注，形成缺血再灌注损伤模型。实验组经对侧股动脉插管注射磁性前列地尔脂微球，对照组注射等量的生理盐水，空白组在皮瓣制备后，不阻断血管，不给任何药物。各组皮瓣外覆盖铷铁硼稀土磁铁。实验组、对照组皮瓣再灌注后2小时、空白组皮瓣制成后7小时，皮瓣均被原位缝合。4.皮瓣血流量测定:用激光多普勒血流仪分别于缺血前，缺血1、2、5小时及再灌注5分钟、30分钟、2小时等不同时间测定皮瓣血流量。5.皮瓣组织中丙二醛（malondialdehyde，MDA）和一氧化氮（nitrogen monoxide， NO）含量:MDA和 NO均是皮瓣缺血再灌注损伤的重要指标。分别在实验组和对照组再灌注后0.5小时及2小时、空白组于皮瓣制成后2小时取皮瓣边缘全层组织制成组织匀浆，以硫代巴比妥酸法测定MDA含量，Griess Reagent法测定NO含量。6.血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的检测:取皮瓣组织标本制成石蜡切片，采用免疫组化法及免疫荧光法检测VEGF的表达。7.平均微血管数目及内径的检测:取皮瓣组织标本制成石蜡切片，进行常规HE染色，检测平均微血管数目及内径。8.皮瓣存活率的测定:采用坐标贴纸法在皮瓣原位缝合后7天测定皮瓣成活面积和设计面积，并推算出皮瓣成活率。9.统计学方法:应用SPSS17.0统计软件行统计学分析。实验结果以均数（±）标准差表示，采用t检验，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示有统计学意义。 结果：1.皮瓣血流量测定：与空白组相比，实验组和对照组随时间延长皮瓣缺血期微循环血流量逐渐减少，缺血5小时测定的皮瓣微循环血流量约为缺血前微循环血流量的30%左右；再灌注后实验组和对照组皮瓣微循环血量均逐渐增加（P<0.05），且实验组皮瓣血流量较对照组显著增多（P<0.05）。2.MDA含量测定：三组皮瓣组织中MDA含量在制成皮瓣即刻测量，结果无显著性统计学差异（P>0.05）。与空白组相比，再灌注0.5h时，实验组皮瓣组织中MDA含量无显著增加，而对照组显著增加（P<0.05）；再灌注2h时，实验组和对照组皮瓣组织内MDA含量较空白组均有增加，但对照组显著高于实验组（P<0.05）。3.NO含量测定：三组皮瓣组织中NO含量在制成皮瓣即刻测量，结果无显著性统计学差异（P>0.05）；再灌注0.5h和2h时，实验组和对照组皮瓣组织中 NO含量较空白组均减少，且实验组高于对照组（P<0.05）。4.VEGF的表达及微血管数目：通过VEGF免疫组织化学、免疫荧光染色及 HE染色观察表明，与空白组相比，对照组平均微血管数目减少，VEGF的表达显著降低（P<0.05）；而与对照组相比，实验组大鼠的腹部皮瓣可见较多新生毛细血管生成，平均微血管数目增多，VEGF的表达增加（P<0.05）。5.皮瓣成活率及皮瓣组织观察结果：7d后空白组皮瓣成活率为100%，实验组皮瓣成活率明显高于对照组，皮瓣成活率为81.6±7.4%，对照组42.1±5.6%，差异有统计学意义（P〈0.05〉。空白组皮瓣颜色淡红，温度及质地未见异常，有毛发生长，未见明显坏死。对照组皮瓣组织大部分呈黑褐色，近端组织少量成活，坏死部分质地干燥呈痂皮状，无弹性，未见毛发生长，皮温明显低于正常，针刺实验阴性。实验组皮瓣组织大部分生长良好，颜色及质地未见异常，有毛发生长，皮温较正常，针刺实验阳性；少部分远端组织呈坏死状，为暗褐色，质地较韧，无弹性，无出血；实验组皮瓣成活面积明显大于对照组。 结论：1.缺血后皮瓣血流量减少，再灌注可使血流量恢复。缺血再灌注可使NO合成减少，MDA水平增多，血管内皮生长因子（VEGF）表达明显减少，平均微血管数目减少，7天后皮瓣成活率显著降低。2.前列地尔靶向治疗可通过增加组织NO含量、减少MDA水平，减少氧自由基生成及脂质过氧化物，减轻皮瓣缺血再灌注损伤，增加皮瓣血流量，并增加VEGF的表达和新生血管形成，提高皮瓣成活率。

目录

引言

一、磁性靶向治疗

二、皮瓣移植技术现状

三、前列地尔改善皮瓣移植技术的研究

四、本研究的实用性和先进性

材料与方法

1实验动物

2实验试剂与仪器

3实验方法

4统计学分析

结果

1磁性前列地尔脂微球的测定结果

2大鼠腹部岛状皮瓣缺血再灌注术后皮瓣情况

3皮瓣血流量

4NO的含量

5 MDA的含量

6 皮瓣成活率

7 HE染色组织学检测

8 VEGF表达结果

讨论

1前列地尔脂微球

2磁性前列地尔脂微球的研制和理化性质

3皮瓣移植的缺血再灌注损伤

4磁性前列地尔脂微球靶向治疗皮瓣的缺血再灌注损伤

结论

参考文献

综述：磁性药物靶向治疗的研究进展

攻读学位期间的研究成果

中英文缩略词表

致谢

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