线粒体通透性转运孔在右美托咪定预处理脑缺血再灌注中的作用及机制研究

摘要

目的：本实验通过培养原代海马神经元细胞建立OGD/R模型，作为大脑I/R损伤体外模型，在此基础之上用右美托咪定标准液加入相应处理组的培养液中，并用线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore,MPTP）的开放剂苍术苷对相应对照组进行处理，来观察模拟缺血再灌注期间大鼠海马神经元细胞的MPTP的开放情况，线粒体分裂相关蛋白Drp1、Fis1和细胞色素C（CytC）、凋亡诱导因子（AIF）的表达。探讨线粒体通透性转运孔在右美托咪定预处理脑缺血再灌注中的作用及机制，为以后临床治疗缺血再灌注疾病的治疗提供新的理论依据。 方法：本实验分为两部分，第一部分为预实验，预实验的分组将原代培养出生24h之内的SD大鼠海马神经元细胞，采用氧糖剥夺法建立缺氧复氧模型，随机数字表法分成8组（n=6）：正常对照组（C组，不对细胞进行处理）、赋形剂组（V组，不进行缺氧复氧，加入体积分数为0.0001的二甲亚砜培养6h）、缺氧复氧组（H/R组，采用氧糖剥夺法缺氧6h,复氧20h,建立大鼠海马神经元缺氧复氧损伤模型）、H/R+右美托咪定0.1μmol/L组（D1组）、H/R+右美托咪定1.0μmol/L组（D2组）、H/R+右美托咪定5.0μmol/L组（D3组），H/R+右美托咪定10.0μmol/L组（D4组），H/R+右美托咪定100.0μmol/L组（D5组），D1、D2、D3、D4、D5组在缺氧复氧期间分别加入终浓度为0.1、1.0、5.0、10.0、100.0μmol/L的右美托咪定，缺氧6h,复氧20h。用倒置显微镜观察海马神经元细胞的数量与形态，用细胞增殖与毒性检测试剂盒检测各组神经元细胞活性，第二部分为正式实验：分组为原代培养出生24h之内的SD大鼠海马神经元细胞，采用氧糖剥夺法建立缺氧复氧模型，随机数字表法分成6组（n=6）：正常对照组（C组，不对细胞进行处理）、赋形剂组（V组，不进行缺氧复氧，加入体积分数为0.0001的二甲亚砜培养6h）、缺氧复氧组（H/R组，采用氧糖剥夺法缺氧6h,复氧20h,建立大鼠海马神经元缺氧复氧损伤模型）、H/R+右美托咪定1.0μmol/L组（D组）、H/R+苍术苷（A组）、右美托咪定+苍术苷组（D/A组）。用倒置显微镜观察海马神经元细胞的数量与形态，用细胞增殖与毒性检测试剂盒检测各组神经元细胞活性,用细胞内钙离子检测试剂盒测细胞质中的钙离子浓度，用自分光分度仪检测海马MPTP开放情况，用Western blot检测线粒体分裂相关蛋白Drp1、Fis1和细胞色素C（CytC）、凋亡诱导因子（AIF）的表达。 结果：在预实验中，与H/R组比较，D4、D5组神经元细胞生长明显受抑制，在后续实验中舍去，D2组较D1、D3组神经元细胞数量和活性明显增高(P＜0.05)。在正式实验中，与C组比较，V组各指标差异无统计学意义(P＞0.05)，H/R组神经元细胞数量和活性明显降低；且钙离子浓度和Drp1、Fis1、CytC、AIF蛋白的表达显著增高(P＜0.05)，MPTP吸光值减少程度增大，MPTP开放程度增加，（P＜0.05）；与（H/R）组比，D组、(D/A)组MPTP吸光值减少程度降低，MPTP开放程度减小，（P＜0.05）；且钙离子浓度和Drp1、Fis1、CytC、AIF蛋白的表达显著降低(P＜0.05)。 结论：右美托咪定（0.1-5.0μmol/L）可以明显减轻大鼠海马神经元细胞缺氧复氧损伤中细胞的凋亡，其中1μmol/L是右美托咪定最佳的脑保护浓度；右美托咪定减轻缺氧复氧对大鼠海马神经元细胞的损伤，可能通过抑制海马神经元细胞MPTP的开放发挥作用。

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